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冬虫夏草菌群体遗传学及其与寄主昆虫之间的进化关系研究 【摘要】：冬虫夏草是我国传统的名贵珍稀中药 ,是由冬虫夏草菌 (Ophiocordycepssinensis)侵染青藏高原高山草甸土中的蝙蝠蛾幼虫 (鳞翅目蝙蝠蛾科 )而形成的僵虫与子座的复合体。由于具有独特的药 用价值 ,加上野生资源不断减少、市场价格飙升 ,冬虫夏草受到国内外 各界人士的关注 ,也成为近年科学研究的热点。然而 ,冬虫夏草的规模 化人工栽培一直没有实现。 冬虫夏草菌与其寄主昆虫在长期的进化过 程中形成严格的专性寄生关系 ,但由于缺乏冬虫夏草菌与寄主昆虫之 间进化关系的系统研究 ,在冬虫夏草人工栽培实践中 ,人们并没有重视 冬虫夏草菌和寄主昆虫的地理来源问题 ,这已影响到冬虫夏草的产业 化进程。本论文首先选择代表性产地广泛采集冬虫夏草样品； 通过构 建 shotgun 基因组文库筛选冬虫夏草菌多种高效的分子标记 ,同时选 择寄主昆虫适宜的多基因标记； 利用分子群体遗传学方法分析冬虫夏 草菌与寄主昆虫的遗传结构； 根据冬虫夏草菌与寄主昆虫多基因序列 分析的结果 ,分析冬虫夏草菌与寄主昆虫之间的进化关系。研究结果 不仅从分子水平上为冬虫夏草菌与寄主昆虫的分类、 演化和协同进化 关系的建立等科学问题提供理论证据 ,而且对冬虫夏草的资源保护及 人工规模化培育具有重要的意义。本研究取得的主要结果如下： 1) 从西藏、 青海、 四川、云南、甘肃等地采集了 900 多枚冬虫夏草样品 , 并从中分离了 59 个冬虫夏草菌株。所分离的菌株经形态学和分子序 列验证 ,全部为中国被毛孢 Hirsutellasinensis,即冬虫夏草菌的无性型。 2)利用冬虫夏草菌株 YN07-8 构建了 shotgun 基因组文库。从所构建 的文库中随机挑选约 260 个克隆进行测序 ,并从所测序列中选择约 30 条序列 (以 OSRC 起始命名 )设计 PCR 扩增引物。用设计的引物从 4 个地理距离较远的冬虫夏草样品中扩增相应的基因。 通过对这些基因 片段在 4 个不同样品间核苷酸多态性的比较 ,找出碱基变异较大的基 因片段 (如 OSRC14、OSRC32)用于后面冬虫夏草菌群体遗传学的研 究。 3) 以 121 个冬虫夏草样品为材料 ,使用 7 个分子标记基因 (nrDNAITSMAT1-2-1 、csp1、OSRC14、OSRC17、OSRC27 和 OSRC32) 分析冬虫夏草菌的群体遗传结构。研究发现 ,冬虫夏草菌不但在地理 种群内而且在地理种群间都表现出明显的遗传分化。 西藏南部种群具 有最高的遗传多样性 ,可能是冬虫夏草菌的起源中心。冬虫夏草菌的 遗传分化程度随纬度梯度的增加而增加 ,而与经度和海拔的相关性不 强。分子钟和生物地理演化分析的结果显示 ,冬虫夏草菌可能于 22.59 百万年前