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中性粒细胞分离实验步骤 中性粒细胞分离实验步骤 一、中性粒细胞初步分选 试剂与耗材：人淋巴细胞分离液、 RP16４0、1５mｌ离心管 4 支,棉球,止血带、碘伏、采血针 ,５mlE ＤTA 抗凝采血管 2 支。 1mｌ 枪及枪头 . 分离步骤 : 所有试剂恢复至室温 ; EDTA 抗凝采血管收集人外周血 10mｌ ; 分别将 5mｌ外周血加入５ mｌ人淋巴细胞分离液中（ 15ml 离心管中进行 )； 注意动作轻柔缓缓加入 ; 4. ５ 00g 离心,3０-３5 分钟,室温； 离心后收集低带中性粒细胞，分两层 ,第一层为单核细胞 ,第二层为中性粒细胞;(若离心后分层不明显则多离心 5—10 分钟) 将 RP１6４０用纯水稀释为 50％RP１64０用于重悬中性粒细胞 ,恢复细胞活性。(5-１ 0 分钟) ４ 00g 离心 10 分钟 ,去上清，收集中性粒细胞， 重悬于Ｒ P16４0 中,细胞计数。 二、中性粒细胞磁珠分选 试剂耗材及设备：磁力分选器 ,磁柱， CD15 磁珠试剂盒，磁珠分选缓冲液 50ml ， RP1６４０，1ｍl 枪及枪头 ,２0 微升枪与枪头 ,１5ｍ l 离心管 4 支，细胞计数板。步骤: 制冰,保证磁力分选器可以放入冰盒内操作，在４— 8℃内进行分选； 配液磁珠分选缓冲液（ 50ml PBS 液中含 2mm ｏ l/L ED Ｔ A,０.5%B ＳA，P Ｈ=7。2); 将上步初步分选的中性粒细胞悬液 300g 离心 10 分钟，去上清 ; ７ 细胞重悬于磁珠分选缓冲液中，１ 0 细胞重悬于 80 微升缓冲液中； (如细胞 数多按倍数增加 ) 10７细胞中加入 20 微升Ｃ D15 磁珠;充分混匀放入２—８℃避光孵育１ 5 分钟; 用 1—2ｍl 缓冲液洗涤细胞／ 107 细胞， 300g 离心 10 分钟,去上清； 重悬细胞于缓冲液中 ,108 细胞重悬于 5０0 微升缓冲液中 ; 将磁力分选器置于冰盒中 ,用３ｍｌ缓冲液冲洗磁柱 ; 将含有中性粒细胞的缓冲液加入磁柱中 ; 用缓冲液冲洗磁柱，每次３ ml, 冲洗 3 次; 除去磁场 ,把磁柱放置于１ 5ｍｌ离心管上， 用 5ml 缓冲液加压快速冲洗磁柱 ; 离心管中收集的便是中性粒细胞； 30０g 离心去上清，重悬细胞于 1０ ml 细胞培养液中 ,细胞计数。 三、细胞活力检测 步骤： 1、4% 台盼蓝母液：称取 4ｇ台盼蓝 ,加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至 1０0ml ， 用滤纸过滤 4 度保存。使用时 .用 PＢS 稀释至０ .４％ . 2、胰酶消化贴壁细胞 ,制备单细胞悬液 ,并作适当稀释 . ３、染色：细胞悬液与 0.4％台盼蓝溶液以 9： 1 混合混匀。 (终浓度 0．０4％ ) 4、计数:在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。 ５、镜下观察 ,死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。 6、统计细胞活力 :活细胞率（％ )= 活细胞总数 /（活细胞总数 +死细胞总数 ) ×１０ 0% 四、细胞分组铺板给药 试剂耗材及设备 :六孔板 2 个，1ml 枪及枪头 ,２ 0 微升枪与枪头， １５ ml 离心管 4 支，细胞计数板 . 10ml 外周血大概可分出 1×107 个细胞； ２． 分为 10 组： ①空白组 ②单Ｐ I 组 ③单 AV 组 ④ＰI 、AＶ双染组 ⑤Ｐ I、AV 、CD15 三染组 ⑥ＬＰ S１μｇ/ｍ l 组 ⑦ LＰS+Nec— 1 50μgｍ/ /mｌ组 l 组 ⑧ LPS+N ｅc-1 5μｇ ⑨Neｃ-1 50μg／m ｌ组 ⑩Ｎｅ c—１ 5μg/ml组. 3。铺板 ,每孔 1mｌ细胞悬液，给药 ,空白组给予 DMSO. （ LPS 浓度选择 1μｇ/ ｍ l,因为此浓度刺激中性粒细胞后出现凋亡率较低 ,坏死率较高。 Ｎec－１浓度作用于神经细胞为 7μｇ／ ml — 50μg／ mｌ） 五、细胞凋亡率检测 耗材试剂： 1ml 枪及枪头 ,20 微升枪与枪头 ,1.5mｌ离心管 15 个，凋亡检测试剂盒,CD15 抗体. １． 细胞培养一段时间后（ 3、6、12、2４、36 小时)，离心 (20０0ｒ pm 离心 5min ）收集细胞 ; ５用 PBS 洗涤细胞二次 (200０rp ｍ 离心 5min ）收集 1~5×１ 0 ５ 加入 500μL 的 Bin ｄiｎｇ Buffe ｒ 悬浮细胞； 加入 5μ L AV 混匀后，加入 5 μL PI, 混匀; ５． 室温、避光、反应５ ~15ｍin ； 6． 上机检测 ,分析结果。 细胞;