氨基酸工艺学课件.ppt

2）结构类似物作用机理 与变构酶的变构部位结合 阻遏酶的合成 抑制氨酰基-tRNA合成酶活性 抑制对应氨基酸向细胞内摄取 3）增强结构类似物抑制生长的方法 改变碳源或氮源 添加抑制剂 选择缺陷菌株 添加合成酶的抑制剂 增大结构类似物的细胞膜透性 优先合成转换 增加前体物质的积累 除去终产物 选育条件突变菌株 选育不生成副产物菌株 选育代谢拮抗物质菌株 第二节 用细胞内基因重组手段选育氨基酸生产菌 细胞内基因重组是自然界普遍存在的现象，称为杂交育种。 原生质体融合 转导 转化 原生质转化 一、利用原生质融合技术选育氨基酸生产菌 原生质融合 将遗传性状不同的两个细胞融合称为一个新细胞的技术。 便于筛选融合子的方法： 亲株通常均要带有抗性或营养缺陷遗传标记，且遗传标记基因不一定与目的基因连锁。 原生质体的获得 影响原生质体形成的因素： 菌体生理状态、菌体的前处理、酶的浓度、酶解时间、酶解温度等。 （1）菌体处于对数生长期后期； （2）添加甘氨酸、青霉素、D-环丝氨酸； （3）控制酶的浓度、作用时间； （4）破壁后置于高渗环境。 原生质体形成率： 菌数可采用平板计数法计量 原生质体的再生 再生：指原生质体能重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能生长、繁殖，是原生质融合育种的必要条件。 影响的因素： 菌种自身特性、原生质体制备的条件、再生培养基的成分、再生培养条件。 原生质融合 融合促进剂 聚乙二醇（分子量1000-6000） 浓度：40%左右 Ca2+：50-100mmol/L pH：碱性有利于提高融合频率 电场诱导 （1）影响因素 电场梯度、溶液导电性、交流电场的频率和强度等 （2）特点 融合频率高、重组几率大、操作简单快捷。 细胞融合仪 AJ11082 AJ11638 震荡培养 添加青霉素 离心 高渗溶液洗涤 酶解 离心 等量混合的原生质体 加PEG融合 离心 悬于pH10.5高渗溶液 高渗选择培养基再生 挑选融合子 性能鉴定 赖 氨 酸 生 产 菌 选 育 WY10 ASl.495 震荡培养 添加青霉素 离心 高渗溶液洗涤 酶解 离心 等量混合的原生质体 加PEG融合 离心 悬于高渗溶液 高渗选择培养基再生 挑选融合子 性能鉴定 L 1 异 亮 酸 生 产 菌 选 育 二、利用转导法选育氨基酸产生菌 转到作用：利用转导噬菌体为媒介将供体菌部分DNA片段导入受体菌，从而使受体菌获得供体菌部分遗传性状的现象。 三个必需组成 供体菌 受体菌 转导噬菌体 供体菌 扩大培养 加入噬菌体 继续培养 氯仿杀菌 离心 上清液 DNase处理 微孔膜过滤 裂解液 受体菌 扩大培养 混合 离心 受体菌体 选择培养基 转导子 性能鉴定 转 导 育 种 操 作 利用转导法选育组氨酸产生菌 选育的关键：解除组氨酸生物合成过程的反馈抑制与阻遏；同时，组氨酸酶缺陷。 Hd-16（Hase-） 亚硝基胍诱变 HdMHr581（Hase-+2-MHr） HdTr142、 HdTr51 （TRAr+Haser） P20转导 HT2892 （Hase-+2-MHr+TRAr） 利用转导法选育精氨酸产生菌 选育关键：精氨酸合成系统酶不受阻遏、初始酶的反馈抑制脱敏、精氨酸分解能力丧失。 RA4240 PA3179（Lys-） ArgA+LysA共转导 转导子（Lys+） AT404 利用转导法选育苏氨酸产生菌 选育关键：生物合成限速酶AK和DH、与苏氨酸分解相关的苏氨酸脱氢酶和苏氨酸脱氨酶。 产生菌具备： （1）苏氨酸脱氢酶和苏氨酸脱氨酶缺陷 （2）解除AK和DH的反馈调节 8000（野生菌） Mu-910（TDH-） D-60（ TDH-+TD-） HNr31 HNr59（ 解除反馈阻遏） HNr21（ 解除反馈抑制） AECr174 N-11 E-60 T-570 T-693 转导 转导 苏氨酸转导育种 三、利用原生质体转化法选育氨基酸生产菌 转化：相当大的游离的供体细胞DNA片段被直接吸收到受体细胞，并整合到受体细胞的基因组中，从而使受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的现象。 供体DNA制备 受体细胞对DNA吸收 转化子的选择 供体菌 制备DNA片段 受体菌 制备原生质体 PEG转化 选择培养 转化子 性能鉴定 第三节 用重组DNA技术构建氨基酸工程菌 重组DNA技术亦称基因工程 定向育种的重要技术 工具酶 限制性内切酶 DNA连接酶 寄主-载体系统 质粒是重要的载体。 载体的要求 1）较小的分子质量 2）选择性标记 3）高表达的启动子 4）数种限制内切酶的单位切点 5）能在寄主细胞中多拷贝复制 供体菌 DNA片段 质粒 重组质粒 受体菌 选择培养基 转化子 重 组 DNA