重组dna导入宿主细胞与转化子的筛选.ppt

重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选;第一节??????? 重组DNA向宿主细胞导入 第二节??????? 转化子筛选与判定 第三节??????? 目基因序列测定;第一节??????? 重组DNA向宿主细胞导入;一、转化 : 以质粒作为克隆载体将目基因导入宿主细胞 ;㈠ 原生质体转化法:除去细胞壁后加外源DNA, 经吸收恢复再生培养, 如枯草杆菌。 ㈡ 化学转化法: 1970年Mandel和Higa首先用CaCl2经短暂热休克后, 可使外源DNA转入E.coli。 1.原理: 将对数生长久细菌在0℃下, 用预冷CaCl2溶液低渗处理, 以使菌体细胞壁和细胞膜通透性增加, 菌体膨胀成球形。DNA易于进入细菌细胞内 。 用冷CaCl2低渗处理E.coli使菌体成球形, 外源DNA被吸附, 经短暂42℃热休克, 易于进入胞内而不被降解, 转化效率达105-106, 它与菌株（hsdR-). 2.方法 : （1）感受态细菌制备 （2）转化;（1）感受态细菌制备 接种一环DH5?于2ml LB中 37℃, 振荡过夜 以约1%接种量接入20ml LB中 振荡培养约90’至OD600≈0.2 离心（5K, 5’） 搜集菌体 加入预冷CaCl2（10 ml 100mM） 冰浴20’ 离心 搜集菌体 加入100ul100mM预冷CaCl2 混匀;转化项目 ;㈢电穿孔法 原理: 利用高压脉冲电场, 在宿主细胞表面形成临时性微孔, 质粒DNA可乘隙而入, 在脉冲过后, 微孔复原 。 它比CaCl2法操作更简单, 转化效率高（通常可达109～1010个转化子／μg DNA）, 不仅无需制备感受态细胞, 而且适适用于任何菌株。 ;二、经过接合作用传输质粒DNA;接合---- F+×F－;三、经过转染/转导作用传输遗传物质 ㈠ 转染 病毒（含噬菌体）DNA及其重组子DNA导入宿主细胞（或细菌）过程称转染。 ㈡ 转导 以噬菌体为媒介, 将外源DNA导入细菌过程称转导。 原理: 1.重组外源基因噬菌体DNA, 体外包装成噬菌体, 感染宿主菌, 同时导入外源基因。 2.噬菌体主动感染将含有外源DNA片段重组噬菌体DNA导入宿主菌体内;第二节??????? 转化子筛选与判定 一、利用遗传标志表型特征筛选 二、依据重组子结构特征筛选;一、利用遗传标志表型特征筛选;Ampicillin 抗性? yes yes Tetracycline 抗性? No yes;back;编码b-半乳糖苷酶 ;非重组质粒: 不含有插入 DNA蓝色菌落 重组质粒: 含有插入 DNA: 白色菌落;α-互补原理;二、依据重组子结构特征筛选 1. 重组子大小判别筛选 菌落——提取质粒 ——单酶切——电泳 原质粒 2. 酶切判定 菌落——提取质粒 ——双酶切——电泳 原质粒 3. PCR筛选法 能与插入基因片断两端互补特异引物, 以少许抽提重组子 DNA为模板, 进行PCR分析 ;4. 原位杂交 图5-3、5-4 该法是从基因组文库中筛选目基因首选方法。 5. 斑点杂交 1)重组体DNA或RNA抽提出来, 麻烦 2)抽提纯化, 蛋白质、 杂DNA等降低, 所以能得到更为确切结果, 既可用于定性,对拷贝数进行相对定量。 6. Southern blot杂交法 原位杂交与斑点杂交都只能判定整个重组子中是否会有与探针互补同源片段, 而Southern blot杂交能将同源片断定位于基因;同尾酶BamHI和BglII ;;;;肺炎双球菌转化试验;第三节??????? 目基因序列测定一、目基因序列测定意义;二、目基因测序方法;酶法——双脱氧链末端终止法;①双脱氧－M13体系DNA序列分析法 M13含单链DNA, 在细菌内形成双链环状DNA（RF）。成熟噬菌体含单链DNA分泌到培养液中。 双链DNA（RF）: 克隆载体, 按提取质粒方法从细菌中制备 单链DNA: 测序模板, 从培养基上清中提取 现在常见M13mp18 图5-6;;㈡ 化学（裂解）法 在无NaCl下, 用联氨（肼）可打开C、T碱基, 在C、T碱基发生断裂, 形成T+C组。加入NaCl, 肼切割C形成C组。在中性条件下, 硫酸二甲酯可在G处断开形成G组。加入甲酸可在A、G处断开, 形成G+A组, 最