MTT检测法检测淋巴细胞增殖 .docxVIP

PAGE PAGE 1 MTT检测法检测淋巴细胞增殖 MTT检测法主要反映细胞的能量代谢，是检测细胞增殖活力的一种简便精确?????的办法。MTT是一种噻唑盐，化学名3-(4,5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基溴化四唑，在活细胞生长和增殖过程中，线粒体内的可将黄色的MTT分解成蓝紫色的甲臜颗粒(formazan)，经盐酸一溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD值，甲臜生成量的多少反映细胞增殖的程度。 【材料】1. ICR小鼠 美国癌症讨论所（institute of cancer research,ICR）选育的Swiss小鼠群。2．培养液及试剂 RPMI 1640培养液；Hanks液；刀豆蛋白A (concanvalin A,ConA)，用RPMI 1640液配成lmg/ml，分装小瓶，冷冻保存；MTT 1 mg/ml。3．器具 96孔平底培养板；无菌尖吸管和刻度吸量管；无菌解剖器械;5% C02培养箱（美国NAPCO公司产品）；酶标测定仪（美国BioRad公司产品）。4. 2.5％,75％。【办法】1．常规分别淋巴细胞（可来自外周血，脾细胞等）制成2.5x106/ml的细胞悬液，加入96孔培养板中，2x105/(100微升·孔），每组设3个复孔，然后加入ConA使每孔终于浓度为2ug/ml，同时做不加ConA的阴性对比孔。2．将培养板放入含有5% CO2的37℃培养箱中培养48～72小时，在培养结束前4～6小时，于培养板各孔内加入1 mg/ml MTT液，10微升／孔。 37℃培养6小时。3．各孔内加入0.01 M盐酸一110u1,30分钟内（或加2% SDS 100微升／孔，过夜）用酶标测定仪测OD值，测定波长570nm。【结果】取试验组和对比组3个复孔的平均OD值计算转化值。转化值=试验组的平均OD值-对比组的平均OD值。【注重事项】1．因为本试验需要培养3天才干观看结果，因此在操作时应注重无菌操作，避开细菌污染，导致试验的失败。2．细胞操作要轻柔、快速，以免细胞损伤影响试验结果。3．加入盐酸异丙醇后要在1小时内举行测定，若1小时内不能测定，可将未加盐酸的培养板置4℃保存，测定前取出，室温放置数分钟后再加盐酸异丙醇，依上法测定。羟基荧光素二醋酸盐琥珀酸亚胺脂（CFSE)检测法检测淋巴细胞增殖【原理】羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（5,6-carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使之成为一种良好的细胞标志物。CFSE进入细胞后可以不行逆地耦联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFSE标志荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。依此类推，在一个增殖的细胞群中，各延续代细胞的荧光强度呈对数递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其举行分析，从而得出细胞分裂增殖的状况。【材料】1．用(DMSO）将CFSE溶解成5mmol/L的储存液，-20℃避光保存。用法时，用无血清DMEM培养液稀释成5 umol/L的工作液备用。2．。3. RPMI 1640。【办法】1．常规分别淋巴细胞（可来自外周血，脾细胞等）制成2.5x106/ml的细胞悬液，加入96孔培养板中，2x105/100ul/孔，每组设3个复孔，然后加入ConA使每孔终于浓度为2ug/ml,同时做不加ConA的阴性对比孔。2．将培养板放入含有5% C02的37℃培养箱中培养48～72小时，每孔加入等体积CFSE工作液，于37℃孵育10分钟，用40％体积的冷立刻终止标志10分钟。离心洗涤两次后，用适量的彻低培养液重悬细胞。【结果】流式细胞仪检测。【注重事项】1.CFSE的浓度国外报道从0.5 uM到20 uM都有，建议终浓度为2.5～5uM，浓度太低则荧光强度不够，浓度太高对细胞有毒性，影响细胞增殖。2．加入CFSE后要常常摇匀。