土壤放线菌3423代谢产物的分离纯化及结构鉴定.docVIP

土壤放线菌3423代谢产物的分离纯化及结构鉴定 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：土壤放线菌3423代谢产物的分离纯化及结构鉴定 1 1 材料与方法 2 2 结果与讨论 3 3 讨论 5 文2：红芪多糖的纯化及初步结构鉴定 5 1 材料与仪器 6 2 方法 6 三氯乙酸-正丁醇法 7 3 结果 8 4 结论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 11 正文 土壤放线菌3423代谢产物的分离纯化及结构鉴定 文1：土壤放线菌3423代谢产物的分离纯化及结构鉴定 本实验室建立了K562细胞和对格列卫耐药的K562细胞体外筛选模型［1］，通过筛选1000株土壤微生物发酵液，发现其中十余株放线菌的发酵液对K562细胞生长有强的抑制活性。选取其中一株放线菌3423，对其进行扩大发酵，并对代谢物进行提取、分离纯化、结构鉴定及活性研究。 1 材料与方法 仪器与材料 色谱包括分析型液相色谱仪(大连依利特公司)，Kromasil色谱柱(×150mm，5μm)，配备UV230+型UVVIS检测器，制备型高效液相色谱仪(大连依利特公司)Spherisorb色谱柱(10mm×250mm，10μm)；核磁共振谱(Varian，Inova 600x型核磁共振仪)；质谱(Micromass Zabspec型质谱仪)；制备薄层(HSGF254烟台化工研究院)；反相硅胶ODS()；柱层析及薄层层析用硅胶为青岛海洋化工厂生产；所用试剂为分析纯。 实验菌株是分离自我国江苏地区土壤的放线菌，分离保存方法见 文献 ［1］，本实验选择菌株代号为3423。 发酵 首先将菌种涂布于平面培养基［成分(%)：可溶性淀粉1，葡萄糖2，牛肉膏，酵母提取物，，K2HPO4 ，CaCO3 ，琼脂1，pH=］上，30℃培养6d，挑取多个单克隆菌落接种于种子培养基(成分同平面培养基)上，30℃培养48h，显微镜下观察菌体形态，选择较好的一株作为菌种接种于发酵培养基(成分同种子培养基)，于摇瓶中振荡培养(250ml/500ml)，30℃培养72h。发酵终点pH为左右。 提取 发酵液经离心得到菌丝体和上清液，菌丝体经丙酮浸泡12h、过滤、减压浓缩至无丙酮，乙酸乙酯提取三次；上清液加入AB8大孔吸附树脂，搅拌吸附8h，过滤，AB8用丙酮解吸附，减压浓缩至无丙酮，加等体积乙酸乙酯提取两次；合并菌丝体及发酵液的乙酸乙酯提取液，经无水硫酸钠干燥、过滤和减压浓缩至褐色浸膏(2g) 分离与纯化 初提物()采用C18反相色谱分离，以55%甲醇洗脱，收集流份以TLC分析结果进行合并，得到11个组分(A1～A11)。A1(119mg)再经过硅胶柱层析，制备正相薄层色谱纯化(氯仿∶甲醇=40∶1)，得到化合物I；A4(414mg)经过硅胶柱层析分离，采用反相HPLC制备色谱纯化(60%甲醇)，得到化合物II；A7(193mg)经过制备HPLC得到化合物III(18mg)； A9经过制备薄层色谱和凝胶过滤得到化合物IV；A10()经过正相制备薄层层析(氯仿∶甲醇=100∶)得到化合物V(8mg)和B10两个组分，B10再经过反相HPLC制备色谱纯化(55%甲醇)得到化合物VI( 活性测定 将各化合物配制成不同浓度的溶液，加入K562细胞中。K562细胞系用含10%小牛血清PRMI1640培养液，37℃，通入5% CO2的培养箱中培育72h，加入20μl MTT溶液，继续孵育4h，吸去细胞悬液，加入120μl DMSO溶解沉淀物，酶标仪490nm下测定其光密度值。 2 结果与讨论 结构鉴定 化合物I 分子式C7H10O4，1HNMR(CDCl3)δ(1H，dd，，)，(1H，dd，，6Hz)，(1H，dd，，)，(3H，s)，(3H，s)，数据与文献报道一致［2］，经鉴定为6甲基3羟基5甲氧基二氢吡喃4酮。 化合物II 分子式C15H18N2O2，1HNMR(DMSO)δ(1H，s)，(1H，s)，(2H，d，)，(2H，dd，，)，(2H，d，)，(1H，d，)，(1H，dd，，)，(1H，dd，，)，(1H，dd，，)，(1H，dqq，，)，(3H，d，)，(3H，d，)。数据与 文献 一致［3］，鉴定为3苄基6亚异丁基哌嗪2，5二酮。 化合物III 分子式C16H18N2O2，1HNMR(CDCl3)δ(1H，s)，(2H，t，，)，(2H，d，)，(1H，t，，)，(1H，s)，(1H，d，)，(3H，s)，(6H，d，)，以上数据与文献一致［4］，鉴定为6亚异丁基3苯亚甲基1N甲基哌嗪2，5二酮。