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甲基强的松龙对深低温停循环大鼠脑保护作用的研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：甲基强的松龙对深低温停循环大鼠脑保护作用的研究 1 1 材料与方法 2 2 结 果 4 3 讨 论 5 文2：亚低温对大鼠急性缺血脑保护作用的研究 6 1 材料与方法 7 2 结果与讨论 8 参考文摘引言： 9 原创性声明（模板） 10 文章致谢（模板） 10 正文 甲基强的松龙对深低温停循环大鼠脑保护作用的研究 文1：甲基强的松龙对深低温停循环大鼠脑保护作用的研究 深低温停循环（deep hypothermic circulatory ar- rest，DHCA）技术自上世纪50年代诞生以来，已广泛应用于复杂和严重的先天性心脏病及大血管手术中，但其可能并发脑损伤的问题尚未得到较好解决，DH-CA术后中枢神经系统的发病率高达4%～25%。DHCA手术后患者近期不同程度出现手足舞蹈症、抽搐，远期出现认知障碍，儿童出现智力发育障碍等神经系统并发症［1］。DHCA后脑组织缺血缺氧导致突触前兴奋性氨基酸（EAA）大量释放和再摄取减少，从而激活突触后N 甲基D 天门冬氨酸（NMDA）和α氨基 3羟基 5甲基4异戊丙酸（AMPA）受体，引起大量K+外流和Na+、Ca2+内流，造成渗透分解和Ca2+相关性损害。本实验通过观察甲基强的松龙（MP）对DHCA大鼠脑NMDA受体1（NMDAR1）蛋白表达的影响，以探讨其脑保护机制。 1 材料与方法 仪器与试剂 早产儿培育箱、自制大鼠冰窝、水合氯醛（南京市儿童 医院 提供）、MP（美国辉瑞制药公司）、NMDA受 体R1 （Santa Cruz公司），羊抗兔即用型SABC免疫组化检测试剂盒SA1022（武汉博士德公司）、DAB显色剂（武汉博士德公司）、多聚赖氨酸（美国Sigma公司）、荧光倒置显微镜（德国蔡司）、801图像分析系统（江苏 捷达） 动物 成年健康雄性普通级SD大鼠（南京医科大学实验 动物中心）175只，体重250～300 g，随机分为3组，A组（假手术组）15只;B组（DHCA模型组）和C组（MP处理组）各80只，每组再分为DHCA后2、6、12 h，1、2、3、7 d共7个小组，每小组10只，其中DHCA后6 h、1 d 两个组为15只。术前6 h 禁食禁水。A组仅暴露双侧颈总动脉，不降温不阻断;B组深低温停循环60min;C组于深低温停循环前30 min腹腔注射MP，剂 量为30 mg ·kg-1。 大鼠DHCA模型建立 术前30 min肌肉注射阿托品 mg·kg-1，5%水合氯醛6 ml · kg-1腹腔注射麻醉，大鼠仰卧固定于实验台上。温度计插入肛门3 cm，用胶带将其与鼠尾相 固定，监测肛温。颈部正中切口，分别游离两侧颈总动脉及左、右颈外动脉，并双重过线。游离一侧股动脉，动脉置管，取动脉血作血气分析后，用肝素充满连接管后接压力换能器，多功能监护仪监测血压、心电变化及外周血氧饱和度。最后将大鼠放入特制的冰窝，物理降温，每隔5 min记录体温、心率、血压以及血氧饱和度，调整降温速度。当肛温降至21 ℃时，将大鼠取出，取动脉血做血气分析后，经左股动脉进行肝素化（肝素钠300 IU ·kg-1）。随后用24G静脉留置针顺行穿刺左颈外静脉，扎线固定后与三通相连。接着阻断两侧颈总动脉，最后用24G静脉留置针逆行穿刺颈外动脉，扎线固定 留置针，与左侧颈外静脉的静脉留置针相连，开始转流。转流后，将体温维持在（21±1）℃之间，并记录体温、心率、血压以及血氧饱和度。停循环60 min后，拔出颈外动脉处留置针并结扎，回收其管道内血液，经左侧颈外静脉输入，再退出其管内留置针并结扎。最后 松开两侧颈总动脉处动脉夹，恢复颈总动脉血流，检查穿刺处无出血后，逐层缝闭切口。然后将大鼠放入35 ℃早产儿培育箱复温，恢复正常体温4 h后放置室温下正常饲养。 免疫组化方法 检测NMDAR1蛋白表达各组取10只大鼠于DHCA后相应时间点，用含4%多聚甲醛的 mol·L-1磷酸缓冲液经心脏升主动脉灌流固定，断头置于冰盒玻璃板上取出全脑，放入同样固定液中再固定约24 h，常规脱水石蜡包埋切片，厚度4μm，取4张连续切片，操作步骤按SABC试剂盒 操作说明进行，阴性对照以PBS代替一抗。应用捷达801分析软件测定阳性细胞的灰度值，每张切片随机选择4个高倍视野（×400）观察并取其平均值，以灰度值来表示NMDAR1的表达水平，灰度值越高，免疫组化染色越浅，NMDAR1表达越低。 脑组织超微结构观察 于DHCA再灌注后6 h和1 d，各组取5只大鼠处死，每只大鼠于海马区取1 mm×1 mm×1 mm的小块 组织，于%戊二醛固定后，经 mol