人微小病毒B19感染与Kikuchi病的相关性.docVIP

人微小病毒B19感染与Kikuchi病的相关性 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：人微小病毒B19感染与Kikuchi病的相关性 1 1材料和方法 2 文2：人细小病毒B19感染与类风湿性关节炎相关性医学 6 1对象和方法 6 参考文摘引言： 9 原创性声明（模板） 10 文章致谢（模板） 11 正文 人微小病毒B19感染与Kikuchi病的相关性 文1：人微小病毒B19感染与Kikuchi病的相关性 0引言 组织细胞性坏死性淋巴结炎(KikuchiFujimoto Disease, KFD)由Kikuchi和Fujimoto于1970年首先报道. 是一种主要累及淋巴结的自限性全身性疾病，世界各地均有报道，但以东方青年女性多见. 其病理特征主要为淋巴组织散在灶片状坏死，伴有大量组织细胞浸润，易与淋巴瘤混淆，病因尚不清楚. 曾有研究者发现在系统性红斑狼疮和嗜血细胞综合症伴发KFD样淋巴结改变患者中检测到人微小病毒B19［1-2］，但对于B19病毒与原发性KFD的关系，仅Chiu等［3］用免疫组化的方法检测了10例KFD患者的淋巴结活检标本，但未得到阳性结果. 在此，我们观察了人微小病毒B19基因组DNA及病毒衣壳蛋白在原发性KFD中的表达情况，以探讨二者的关系. 1材料和方法 材料KFD组织活检标本32(男11,女21)例来源于第四军医大学西京 医院 及唐都医院病理科，均经HE及CD68免疫化学染色并结合临床表现确诊（图1）. 患者年龄10～69(中位年龄25)岁. 31例(97%)来源于颈部淋巴结；16例(50%)发病时有发热. 所有患者均无皮疹、关节炎等症状，自身抗体阴性. 同时，以13例乳腺癌或胃癌患者未转移的淋巴结做为标本对照. 所有活检标本均经常规固定，石蜡包埋. 实验过程及结果观察均采用双盲法. 地高辛标记及检测试剂盒（Roche公司）； Taq DNA聚合酶和dNTP（TaKaRa公司）；鼠抗微小病毒B19衣壳蛋白VP1/VP2 mAb（英国Novocastra公司）；CD68 mAb（DAKO公司）；染色HistostaiAP试剂盒（北京中山分装，德国Zymed公司）； 显色用NBT/BCIP（Roche公司） 图1组织细胞性坏死性淋巴结炎HE ×200 方法 探针的制备以PCR扩增所得173 bp大小的B19病毒基因组DNA片段(对应于病毒基因组序列的3400～3572 bp)，经测序验证后作为标记探针的模板. PCR引物依据 文献 ［4］由上海生工生物工程合成，所用标记方法依据试剂盒说明书. 原位杂交操作方法依据说明书及文献［5］. 石蜡切片经二甲苯脱蜡，逐级乙醇脱水， mol/L盐酸酸化10 min， g/L蛋白酶K 37℃消化10 min. mol/L PBS洗后逐级乙醇脱水，空气干燥. 预杂交30 min后每张切片加15 μL B19特异性探针，95℃变性10 min，聚冷10 min后于湿盒中42℃过夜. 逐级2×SSC, 1×SSC, ×SSC, ×SSC, ×SSC振洗. 封闭缓冲液37℃封闭30 min，加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体置37℃，3 h. Washing缓冲液振洗30 min，加入NBT/BCIP混合物避光显色. 观察到明确阳性信号后终止显色，脱水、透明、中性树胶封片. 以预杂交液和标记试剂盒所带标记上地高辛的质粒pbr328线性DNA做为阴性对照. 免疫组织化学组织片经梯度乙醇脱蜡至水，经3 mL/L过氧化氢―甲醇封闭内源性过氧化物酶、100 g/L BSA封闭非特异性结合位点后，加入B19特异性 mAb 4℃过夜. 第2日切片经37℃复温、PBS洗后加入生物素化二抗于37℃孵育20 min，PBS洗，加入碱性磷酸酶标记的抗生物素复合物，37℃孵育20 min，PBS洗后加入NBT/BCIP避光显色. 阳性信号出现后终止显色，脱水、透明、中性树胶封片. 染色中以相同Ig浓度抗人神经胶质酸性蛋白抗体(与B19抗体同属IgG G1亚类)和PBS分别做替换对照和阴性对照. 原位杂交-免疫组化双标记免疫组化依上述方法进行. 100 g/L BSA封闭非特异性结合位点后，高压修复抗原表位. 加入抗人组织细胞单抗表面标记CD68 mAb于37℃孵育2 h，PBS洗，加入生物素化二抗，37℃孵育20 min，PBS洗，加入标记过氧化物酶标记的抗生物素复合物，37℃孵育20 min，PBS洗后加入DAB显色. 阳性信号出现后终止显色，进入原位杂交染色程序，方法同前述. 满意阳性信号出现后切片脱水、透明、中性树胶封片.统计学处理：B19病毒原位杂交及免疫组化阳性例数在两组中分别以阳性率表示，两组之间差别做