趋化因子受体CCR5胞外段重组蛋白的克隆表达纯化及鉴定.docVIP

趋化因子受体CCR5胞外段重组蛋白的克隆表达纯化及鉴定 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：趋化因子受体CCR5胞外段重组蛋白的克隆表达纯化及鉴定 1 1材料和方法 2 文2：导向性IFNα2aαMSH基因的克隆表达纯化及鉴定 7 1材料和方法 7 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 趋化因子受体CCR5胞外段重组蛋白的克隆表达纯化及鉴定 文1：趋化因子受体CCR5胞外段重组蛋白的克隆表达纯化及鉴定 0引言 趋化因子受体5(CCR5)是HIV1感染初期病毒进入体内最重要的辅助受体［1］，近几年来，以CCR5为靶点的抗HIV1策略倍受关注，通过小分子拮抗剂、单克隆抗体及基因干涉等不同手段减弱或降低细胞表面CCR5的功能达到对抗HIV1感染的目的［2-5］. 其中以CCR5为靶向的自体疫苗开辟了艾滋病疫苗研究的新途径［6］. CCR5自体疫苗通过诱导机体自身产生针对自身分子CCR5的抗体进而与细胞表面的CCR5结合，降低细胞表面的CCR5的数量，减少了HIV1病毒感染的机会，达到预防HIV1感染的效果. 我们构建人CCR5胞外段重组蛋白表达载体，对获得的重组蛋白纯化、复性. 为构建CCR5自体蛋白疫苗提供实验依据. 1材料和方法 材料各种限制性内切酶、T4DNA连接酶（TaKaRa公司）； DL2000 DNA marker（大连宝生物工程公司）；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒（上海博亚生物技术有限公司）；蛋白marker羊抗鼠二抗（华美公司）；小鼠抗人CCR5 mAb（RD公司）. 其他试剂均为国产分析纯. 原核表达载体pET22b(+)质粒为本室保存. 宿主菌为大肠杆菌BL21. 5L发酵罐（B. braun 公司）. 4℃高速离心机、冻干机（Beckman公司）. 凝胶柱填料SephacrylS300， SephacrylS100及纯化设备（Ameham Pharmacia Biotech公司） 方法 胞外段基因的合成分析SwissPro蛋白质数据库CCR5的结构，截取CCR5胞外4个片段NTerm,ECL1,ECL2,ECL3的氨基酸序列，分别为NTerm:MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAAR(31)；ECL1：YAAAQWDFGNTMCQ(14)；ECL2:QKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQTLK(30)；ECL3:NTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAM(22). 应用柔性linker（氨基酸序列为GGGGS）分别串联，获得模拟CCR5胞外片段的氨基酸序列(命名为：rCCR5)，按照已公布的人CCR5的基因序列，于5′端插入NdeⅠ酶切位点,3′端引进终止密码子TGA并插入SalⅠ酶切位点，依据大肠杆菌偏爱的密码子，送交上海生工生物技术公司合成目的基因. (+)CCR5表达载体的构建将含有合成目的基因的质粒pUC57经NdeⅠ和SalⅠ双酶切后，回收360 bp左右的小片段，同时用NdeⅠ和SalⅠ双酶切pET22b(+)，回收大片段. 建立连接体系，16℃连接过夜. 连接产物转化感受态DH5α细胞，提取质粒，经酶切鉴定和DNA测序正确后获得含有rCCR5基因原核表达载体，命名为pET22b(+)CCR5. (+)CCR5原核载体的表达pET22b(+)CCR5转化感受态BL21细胞，挑取含重组表达质粒的大肠杆菌BL21单菌落并接种于5 mL含100 mg/L氨苄青霉素（Amp）的新鲜LB培养液中, 37℃摇床培养过夜, 次日以1∶100接种于含100 mg/L Amp的新鲜LB培养液中, 37℃继续培养至细菌密度达到A600 nm=～, 1 mmol/L IPTG诱导，4 h后收菌，小规模培养及诱导后离心收集菌体, SDSPAGE检测目的蛋白的表达和存在形式. 工程菌的发酵从活化的LB平板上挑选单菌落接种于含LB的试管中, 37℃培养10 h,转种至含200 mL LB的三角瓶中, 37℃培养过夜. 次日将种子液接种于5 L发酵罐. 控制发酵温度37℃，转速250～450 min、通气量3～5 L/min，pH . 培养至A600 nm=8时,1 mmol/L IPTG诱导，继续培养4 h,终止发酵,收集菌体、称质量，-20℃冰箱保存备用. 取少量菌体处理后用SDSPAGE 检测目的蛋白的表达. 目的蛋白包涵体的分离和洗涤取10 g发酵菌体, 按1 g湿菌质量对7 mL的比例, 用裂解缓冲液STE (50 mmol/L TrisHCl, pH , 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA)重悬, -20℃过夜. 次日于室温水浴中