建立大鼠前庭器官体外培养模型及观察佛波酯作用下的超微结构变化医学.docVIP

建立大鼠前庭器官体外培养模型及观察佛波酯作用下的超微结构变化医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：建立大鼠前庭器官体外培养模型及观察佛波酯作用下的超微结构变化医学 1 1材料和方法 2 文2：大鼠体外循环模型的建立 5 1材料与方法 7 9只大鼠均顺利停机，自主呼吸恢复正常。 9 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 13 正文 建立大鼠前庭器官体外培养模型及观察佛波酯作用下的超微结构变化医学 文1：建立大鼠前庭器官体外培养模型及观察佛波酯作用下的超微结构变化医学 在 现代 医学和生物学研究中已广泛应用了组织培养技术，它具有在体内研究中无法比拟的优点. 体外培养模型的建立克服了在体内研究中无法解决的难题，应用体外培养技术可拓宽内耳研究的范围，为研究耳聋细胞学的机制和 治疗 提供一个模型系统，并使体外条件下内耳的病理、生理及药 理学 研究能得以深入进行［1-3］. 我们在建立体外前庭器官培养模型的基础上，采用透射电镜技术观察在蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）活化剂佛波酯(phorbol myristate acetate, PMA)诱导后的前庭上皮细胞超微结构的改变. 1材料和方法 材料 新生2 d的SD 大鼠20只，雌雄不限，体质量(±)g，（第四军医大学实验动物中心）；Dulbecco改良细胞培养基（dulbeccos modified eagles medium, DMEM），HEPES，PMA（美国Sigma公司）；Hank液按配方配制［4］；SZ40型解剖显微镜，IX7型倒置显微镜（Olympus公司）；37℃培养箱（美国SHELLAB公司）；显微手术器械1套、超净工作台等；ULTRACUT UC6型超薄切片机（德国Leica公司）. DMEM 的配制： 25 mmol/L HEPES，100 mL/L灭活的胎牛血清，1×105 U/L青霉素. 自制鼠尾胶原：取大鼠鼠尾一根，750 mL/L 乙醇浸泡30 min，在无菌条件下抽取肌腱，置于平皿中，取 g剪碎肌腱浸予已灭菌的20 mmol/L醋酸溶液150 mL中，4 ℃冰箱放置并断续摇动，48 h后移入无菌离心管，4000 min离心30 min，吸取上清液，10 磅10 min高压灭菌后分装小瓶，-20 ℃冰箱保存. 培养前1 d包被培养板. Hank液配制按 文献 ［4］的方法逐步加入各成分，高压蒸气灭菌后pH值调节至～. 方法 体外前庭器官培养模型的建立 按照Lambert的方法［5］，取新生2 d大鼠，-20 ℃冰箱冷冻麻醉5 min后全身浸入750 mL/L乙醇5 min，无菌条件下断头，置于冰的Hank液中，在解剖显微镜下取出椭圆囊，打开囊壁，去除耳石，用吸管悬滴将椭圆囊移入鼠尾胶包被过的24孔培养板中央，放于37 ℃，50 mL/L CO2培养箱，待组织贴壁后加入适量DMEM高糖培养液，置于培养箱中培养. 每日于倒置显微镜下观察移植物色泽及培养液情况，隔日将原液吸出，加入等量培养液. 培养至1，3，5和7 d取出固定，透射电镜观察. 实验分组 将新生2 d大鼠10只分为实验组及对照组，每组5只. 无菌条件下取材后培养过夜，实验组加入含PMA （×10-4mmol/L）的培养液，培养30 min，2 h和6 h后，戊二醛固定. 电镜标本制备 椭圆囊斑置于40 mL/L戊二醛液固定12 h，然后依次进行锇酸后固定、丙酮梯度脱水、丙酮及环氧树酯浸透包埋步骤，超薄切片机行超薄切片，厚70 nm. 醋酸双氧铀、枸橼酸铅双染，JEM2000EX透射电镜观察并照相. 2结果 前庭器官体外培养模型的建立 培养物在未被污染的培养液中培养7 d，培养液无混浊，但色泽由橘红渐变黄，倒置显微镜下观察培养物呈半透明状，色泽无发黑，置入培养板中30 min贴壁，加液无飘浮，12 h可见梭形成纤维样细胞生长（图1A），24 h可见内皮细胞生长并呈铺路石样增长（图1B）；实验组培养物与对照组无明显区别. 电镜结果 对照组在1～5 d的超微结构无明显差别，毛细胞生长良好，可见表皮板、纤毛，胞膜完整，核膜无消失，核染色质无浓缩、边集，线粒体、高尔基体、内质网均正常（图2A）. 7 d毛细胞形态稍不规则，但纤毛胞膜完整，胞内细胞器无明显改变；实验组毛细胞纤毛排列整齐，胞膜、核膜无明显改变，核染色质无浓缩、边集，核糖体密集，高尔基体较前发达，内质网轻度扩张（图2B，C），各培养时间段细胞间无明显变化. 3讨论 器官培养是把器官原基、器官的一部分或整个器官放入近似体内环境的培养系统中，保持原有组织间的三维结构和分化程度，使之在体外生存、生长