EB病毒LMP1基因靶向shRNA表达载体构建方法的比较研究.docVIP

EB病毒LMP1基因靶向shRNA表达载体构建方法的比较研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：EB病毒LMP1基因靶向shRNA表达载体构建方法的比较研究 1 1材料和方法 2 文2：人Smad3的shRNA表达载体构建和鉴定 6 1材料和方法 6 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 EB病毒LMP1基因靶向shRNA表达载体构建方法的比较研究 文1：EB病毒LMP1基因靶向shRNA表达载体构建方法的比较研究 0引言 应用RNA干扰技术阻断EpsteinBarr病毒LMP1基因(EBVLMP1)的表达已成为鼻咽癌基因 治疗 的研究方向之一. 常用的RNA干扰表达载体构建方法为双链退火法，但是由于DNA寡核苷酸单链片段长度在60~70 bp左右，化学合成的错误率高，为EBV-LMP1 基因的RNA干扰载体（pshLMP1）构建带来了不便. 因此我们设计了双链PCR法构建pshLMP1，经过实践证实双链PCR法提高了构建成功率，能够加速RNA干扰技术在鼻咽肿瘤的研究进度. 1材料和方法 材料EBVLMP1mRNA和cDNA序列从GenBank搜索. pTZU6+1载体由重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室保存提供，内含有人U6启动子，能在体内转录产生RNA链，含XbaI和SalI克隆位点. DNA寡核苷酸链由上海英骏生物技术有限公司合成. Taq DNA聚合酶，dNTPs及相应buffer,限制性内切酶SalI, XbaI及相应buffer，T4连接酶均购自Takara 公司. 其余试剂均为自行配制. DNA测序工作由重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室完成. 方法 选择EBVLMP1基因靶位点EBVLMP1 cDNA序列由exon a, b, c三个外显子组成. 在exon c中第747920位碱基中有多个内部重复序列，长度为35 bp： GTCCTGGGACTGTTGTGACTACTGTTACCGGGTGT. 根据siRNA设计原则，选择该重复序列中第323位的21个碱基为靶位点，设计EBVLMP1基因靶向RNA干扰表达载体(pshLMP1) 双链退火法构建pshLMP1 按照图1的策略构建合成DNA寡核苷酸单链其中21nt coding sequence为拟沉默的EBVLMP1靶基因序列. 图1双链退火法构建pshLMP1策略（略） 退火，构建、鉴定pshLMP1重组质粒取等量100 mmol/L的DNA寡核苷酸单链片段混合，在退火缓冲液（100 mmol/L NaCl）中95℃加热5 min，缓慢降至室温，乙醇沉淀法纯化DNA双链，25 g/L琼脂糖电泳鉴定. 双链DNA片段与用SalI和XbaI双酶切的转录载体pTZU6+1进行连接，转化大肠埃希杆菌JM109，Amp抗性筛选，阳性克隆进行菌液PCR鉴定，并测序鉴定插入序列正确与否. 双链PCR法构建pshLMP1 按照图2的策略构建合成EBVLMP1 PCR引物其中两条引物间3′端以10个碱基互补配对（pairing bases）为佳，21nt coding sequence为拟沉默的EBVLMP1靶基因序列. 图2双链PCR法构建pshLMP1策略（略） 双链PCR法扩增，纯化，鉴定以合成的寡核苷酸链同时为模板和引物，进行PCR扩增，反应体系如下： 10×Taq buffer μL, Mgcl2(25 mmol/L)2 μL, dNTPs( mmol/L each)2 μL，上下游引物(20 μmol/L)各9 μL，Taq聚合酶5 U，共25 μL. 反应条件为：94℃ 1 min，94℃ 20 s， 45℃ 20 s, 72℃ 20 s；94℃ 20 s，60℃ 20 s, 72℃ 20 s，循环30次后72℃终延伸10 min，4℃保温. 乙醇沉淀法纯化PCR扩增产物，25 g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳，成像鉴定. 酶切PCR产物及载体，构建、鉴定pshLMP1重组质粒SalI和XbaI双酶切PCR扩增产物和pTZU6+1载体，乙醇沉淀法纯化PCR酶切产物，胶回收载体酶切产物. 双酶切片段与载体进行连接，转化大肠埃希杆菌JM109，Amp抗性筛选，阳性克隆以pTZU6+1载体多克隆位点两侧的通用引物T7P和M13F（T7P: TAATACGACTCACTATAGGG M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT）进行菌液PCR鉴定，并测序鉴定插入序列正确与否. 2结果 靶向DNA双链寡核苷酸链鉴定双链退火法和双链PCR法得到的EBVLMP1靶向DNA双链分别进行25 g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳，证实两种方法均成功获得