铝暴露对大鼠海马蛋白激酶Cγ亚型影响医学.docVIP

铝暴露对大鼠海马蛋白激酶Cγ亚型影响医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：铝暴露对大鼠海马蛋白激酶Cγ亚型影响医学 1 1 材料与方法 2 2 结果 3 3 讨论 5 文2：加味补肝汤对糖尿病大鼠坐骨神经中蛋白激酶Cβ亚型表达的影响 6 1 实验材料 7 2 实验方法 8 3 统计学方法 10 4 结果 10 5 讨论 11 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 14 文章致谢（模板） 14 正文 铝暴露对大鼠海马蛋白激酶Cγ亚型影响医学 文1：铝暴露对大鼠海马蛋白激酶Cγ亚型影响医学 铝是一种具有神经毒性的元素，能影响神经系统的多种功能，特别是能损害人的学习与记忆功能〔1〕。铝可在脑组织中蓄积，引起中枢神经功能紊乱。铝进入脑神经细胞内，干扰脑细胞活动，破坏神经元结构，形成神经纤维缠结，导致中枢神经功能障碍。因此，铝可通过慢性蓄积并作用于中枢神经系统引起神经系统的慢性退行性病变，发挥神经毒性作用〔2〕。本文通过研究慢性铝暴露PKCγ蛋白表达和mRNA表达，来探讨铝暴露损害学习记忆功能的机制。 1 材料与方法 11 材料与试剂 Wistar大鼠( 中国 医科大学动物室)；高速离心机（美国LKB公司）；液闪仪（美国BECK-MAN公司）；鱼精蛋白、兔抗鼠PKCγ抗体和显色试剂盒(美国Sigma公司）；PKCγ引物（北京奥科生物技术有限责任公司）；RT-PCR试剂盒（大连宝生物公司）；辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗（北京中衫生物公司）；［γ-32P］-ATP（北京福瑞公司）；其他试剂均为分析纯。 12 染铝动物模型 选择断乳后Witar大鼠体重30g，雌雄各半，随机分为4组，每组20只。根据本实验室前期所作工作及相关 文献 〔3〕，对照组喂蒸馏水，染铝组分别喂含02%，04%，06%氯化铝的水。待鼠饲养3个月后，给予高频刺激。 13 测量LTP 见文献〔4〕 14 蛋白提取和PKC活性测定 见文献〔5〕 15 检测PKCγ蛋白表达的情况 见文献〔6〕。先测定上述提取液胞浆和胞膜的蛋白含量，再进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）电泳、蛋白的转移，印迹膜与一抗及HRP标记的二抗相继温孵后，经反复漂洗，然后将蛋白印迹显影图扫描，利用Chemi Imager 5500 V2103图像分析软件对实验结果进行分析，灰度值代表蛋白含量，以对照组蛋白含量为100，铝中毒组与其对比。 16 用RT-PCR检测PKCγ的mRNA表达情况 （1)总RNA提取：取大鼠海马50～100mg，按V-gene试剂盒说明书操作提取。(2)cDNA合成：按Takara RT-PCR试剂盒说明书进行逆转录反应，总反应体积20μl。(3) PCR反应：应用Primer Premier 50软件设计引物，PKCγ的上游引物为：5′-ACCAAGCACCCAGGAAAAC-3′ PKCγ的下游引物为：5′-GATGCTGGCTAGAACCAAGC-3′。PCR反应条件：94℃预变性2min，94℃变性30s,515℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环，72℃延伸10min。β-actin的上游引物为5-GCCAACCGTGAAAAGATG-3 β-actin的下游引物为：5′-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3′，产物长度为701bp。PCR反应条件同上。(4) PCR产物的分析：取PCR扩增后的产物51μl进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪扫描成像，利用凝胶自动分析成像软件Chem Image 5500进行灰度值分析，利用β-actin灰度值为内对照，求出PKCγ mRNA量的相对值。 17 统计分析 采用SPSS 100软件进行单因素方差分析。 2 结果 21 血铝和脑铝的浓度（表1) 随铝浓度的增加，血铝和脑铝的浓度随之增加。染铝组与对照组比较,差异有统计学意义（P005)；02%与04%组比较,差异有统计学意义（P001)；04%与06%组比较，差异无统计学意义（P005) 表1 各组大鼠血铝和脑铝的比较（略） 注：与对照组比较，a P001;与02%比较，b P001 22 LTP的测定结果 染铝组大部分大鼠海马齿状回LTP增强幅度与对照组比较均有下降。染铝各组高频刺激后LTP增加的群体峰电位（PS）幅值比率（02%组，04%组，06％组）与对照组相比均明显降低，随着染铝剂量的增加，LTP增加的PS幅值比率逐渐下降；在对照组中高频刺激后PS幅值稳定且增长平均在150％左右，符合正常的生理现象，而染铝组高频刺激后PS幅值基本与初始相同，在45