人胸腺肽β4基因在大肠杆菌中的克隆表达纯化及促血管生成生物活性研究临床医学.docVIP

人胸腺肽β4基因在大肠杆菌中的克隆表达纯化及促血管生成生物活性研究临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：人胸腺肽β4基因在大肠杆菌中的克隆表达纯化及促血管生成生物活性研究临床医学 1 1 材料和方法 2 2 结 果 4 3 讨 论 5 文2：VEGFR2D34GST融合蛋白在大肠杆菌的表达纯化及鉴定临床医学 6 1 材料和方法 7 2 结果 8 3 讨论 10 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 人胸腺肽β4基因在大肠杆菌中的克隆表达纯化及促血管生成生物活性研究临床医学 文1：人胸腺肽β4基因在大肠杆菌中的克隆表达纯化及促血管生成生物活性研究临床医学 胸腺肽β4（thymosin β4,TB4）是从胸腺素组分5（F5）中分离得到的，是生物体内丰度最高且高度保守的一种βthymosin。它不仅存在于胸腺中，还存在机体众多组织中，在参与调节免疫及细胞生理活动等一系列过程中呈现功能多样性，因此引起了研究者的广泛关注[12]。TB4是由43个氨基酸残基组成的多肽，相对分子质量约5 000，等电点，以前多认为其定位于细胞浆中，目前有报道说它也有细胞核的定位[3]。最近报道表明，TB4可以促进毛细血管生成和创伤愈合，降低炎症反应，抑制一些上皮细胞的凋亡，在医学 治疗 疾病中大有潜力[46]。本研究设计并合成TB4的编码基因，在大肠杆菌中实现它的高效表达，进行分离纯化，并进行其促毛细血管生成活性初步鉴定，旨在为今后对TB4蛋白功能的进一步研究和药物开发打下基础。 1 材料和方法 试剂、质粒及菌株 pET28a(+)质粒、大肠杆菌Top10、BL21(DE3)由本实验室保存；PCR试剂、限制性内切酶、Klenow酶、T4连接酶等酶类购自大连TaKaRa公司；IPTG购自华美生物工程公司；3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司；Micro BCA Kit购自PIERCE Chemical公司；NiIDA填料由本实验室提供。 方法 重组质粒的构建 TB4目的基因片段的获得 TB4基因序列来源于NCBI数据库，并根据大肠杆菌密码子偏爱性，对其进行适当的修改。设计5个基因片段，由上海英骏（Invitrogen）公司合成。 TB4基因的拼接 将合成的基因片段1（5′ATG TCT GAC AAA CCG GAC ATG GCT GAA ATC GAA AAA TTC GAC AAA TCC AAA CTG AAG3′）和基因片段2（5′TTT GGA CGG CAG CGG GTT TTT TTC CTG AGT TTC AGT CTT CTT CAG TTT GGA TTT3′）退火，利用Klenow酶延伸补平；相同的方法将基因片段3（5′AAC CCG CTG CCG TCC AAA GAA ACT ATC GAA CAG GAA AAA CAG GCT GGT GAA TCC TAG3′）和基因片段4（5′GGC GAGCT CTA GGA TTC ACC AGC CTG3′）退火补平。两次退火得到2个DNA大片段（A和B）， 将DNA大片段A和B退火延伸即得到TB4基因。 PCR扩增TB4基因 以退火得到的TB4基因为模板，基因片段5 （5′GGAATTC CATATG GAC GAC GAC GAC AAG ATG TCT GAC AAA CCG GAC3′）和基因片段4为引物，进行PCR扩增（图1）。PCR循环参数为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性40 s，58 ℃复性40 s，72 ℃延伸40 s,循环28次；末次延伸为72 ℃ 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶纯化试剂盒纯化。 图1 TB4目的基因合成过程示意图 pET28aTB4重组质粒的构建与测序鉴定 将纯化后得到的TB4基因片段用Nde I和Sac I双酶切，用T4连接酶连接于已同样酶切的pET28a(+)质粒中，再转化大肠杆菌Top10，卡那霉素抗性板筛选阳性克隆，挑单菌落进行PCR鉴定为阳性的克隆送上海英骏（Invitrogen）公司测序鉴定。 融合蛋白His6TB4在大肠杆菌中的诱导表达和纯化 将重组质粒pET28aTB4转化BL21(DE3)大肠杆菌，挑单克隆于1 L含卡那霉素的新鲜LB液体培养基中37 ℃摇菌培养，当其A600达到时，加入终浓度为1 mmol·L-1IPTG，诱导3 5 h；离心收获菌体，进行SDSPAGE分析。将表达菌体重悬于60 ml Buffer B（ mol·L-1Na3PO4, mol·