《发酵工程》02 工业发酵菌种选育.pptVIP

* * 紫外线的诱变育种 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。 例 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。 (二)操作步骤 　1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。 2．将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。 　3．取2～4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。 4．取未照射的制备菌液和照射菌液各o.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。 5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r／min振荡培养4～6h。 6．取中间培养液稀释分离、培养。 7．挑取菌落进行筛选。 亚硝基胍诱变曲霉菌 亚硝基胍(MNNG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。 例 (二)操作步骤 1．单孢子悬液制备 取斜面，加入6ml 0.1mol／L pH6.o的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个／ml，此为待处理孢子悬液。 2．MNNG溶液的制备 用分析天平称取2mg，加入2ml 0.1mol／L pH 6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。 3．诱变处理 吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子悬液中，30℃振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-4稀释度分离培养，30℃ 3天后计数。 4．挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选． （三）杂交育种 指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离筛选具有新性状的菌株。 融合 生长快、产量高 菌B生长快，产量低 菌A生长慢，产量高 细胞壁 细胞壁 溶解酶 细胞膜 营养细胞 原生质体 原生质体融合 融合细胞 原生质体形成 原生质体融合 细胞壁 再生 原生质体融合的基本过程 （1）原生质体融合 （2）基因重组 把外源DNA分子结合到任何病毒、质粒、或其它载体系统中，组成新的遗传物质，并转入宿主细胞内进行繁殖的过程。 可以从复杂的DNA分子中分离出单独的DNA片段。 可以大量生产高纯度的基因片段及其产物。 可以在大肠杆菌中研究来自其它生物的基因。 在高等动植物中也可以发展和建立这种基因操作系统。 基因重组过程 目标DNA片段的获得 与载体DNA分子的连接 重组DNA分子引入宿主细胞 筛选含有所需重组DNA分子的宿主细胞 对外源基因的表达及稳定性的鉴定 第三节 菌种的保藏与复壮 微生物菌种的衰退 菌种的复壮 菌种的保藏 一、菌种的衰退 微生物个体特征 微生物群体特征 各方面 发生变化 营养物质代谢和生长繁殖能力下降 发酵周期延长 抗不良环境的性能减弱 目的产物的产量下降 1、菌种退化的原因： 传代次数太多或不良的培养和保藏条件导致菌种的自发突变或回复突变，引起菌体本身的自我调节和DNA的修复 细胞质中控制产量的质粒脱落或目的基因丢失等 2、防止衰退的措施 1）减少传代次数； 2）创造良好的培养条件； 3）利用单核体传代 4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查； 5）采用有效的菌种保藏方法； 二、菌种的复壮 1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。 a）纯种分离； b）通过寄主体进行复壮； c）淘汰已衰退的个体； 2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。 (一)菌种的提纯 即从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以恢复和建立具有原来生产性状的群体，继续供科研及生产使