胃癌组织及区域淋巴结微转移与胃癌生物学标志基因的临床关系.docVIP

胃癌组织及区域淋巴结微转移与胃癌生物学标志基因的临床关系 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：胃癌组织及区域淋巴结微转移与胃癌生物学标志基因的临床关系 1 1 材料与方法 2 2 结果 3 3 讨论 5 文2：胃癌组织中SOX4基因的突变分析 8 1 材料与方法 9 2 结果 10 4、5为SOX4基因发生突变的癌组织 11 3 讨论 11 参考文摘引言： 13 原创性声明（模板） 14 文章致谢（模板） 14 正文 胃癌组织及区域淋巴结微转移与胃癌生物学标志基因的临床关系 文1：胃癌组织及区域淋巴结微转移与胃癌生物学标志基因的临床关系 胃癌的微转移是指恶性肿瘤在 发展 过程中，肿瘤细胞播散并存活于血液循环、淋巴道、骨髓及组织器官中，而未形成转移结节，其特点是无任何临床表现，且常规检查方法，如影像、病理等均难以发现〔1〕，是胃癌根治术后复发及胃癌患者治疗失败和生存率低的原因之一〔2，3〕。因微转移灶多数小于2 mm，所以通过传统组织学检查癌旁淋巴结并不能诊断出全部微转移〔4，5〕，不过随着 现代 分子生物学技术的发展和新的肿瘤标志物的发现，微转移的检测方法也在不断的更新。本文即应用反转录聚合酶链反应（RTPCR）技术检测胃癌无转移淋巴结（PN0）中细胞角蛋白6（CK6）及细胞角蛋白18（CK18）的表达，对于临床上指导治疗，预测复发，评价预后提供理论依据。 1 材料与方法 研究对象 标本均取自2007年6月～2007年8月河北医科大学第四 医院 普外科行胃癌手术切除的病例，共60例，其中男38例，女22例。年龄52～72〔平均（±）〕岁。每个病例取肿瘤中心部位的癌组织及远离癌组织5 cm以上的正常胃黏膜，以及淋巴结8～15枚（平均10枚）。每枚淋巴结一半送病理，一半保存，从中选取病理检查结果为阴性的淋巴结3枚。离体标本手术切除后立即置于液氮中，后转移至-80℃低温冰箱中保存。 引物设计 引物由南京斯迈特公司合成。CK6、CK18引物的序列设计，见表1。 表1 引物序列、产物大小及GenBank 号（略） 总RNA抽提及鉴定 60例胃癌组织，180枚淋巴结和60例正常组织中分别加入提取试剂(Invitrogen)1 ml，电动匀浆1～2 min，匀浆液室温放置5 min后加氯仿200 μl，振荡15 s，12 000 min 4℃离心15 min；上层水相移至另一Eppendorf 管，加异丙醇500 μl，混匀室温放置10 min，12 000 min 4℃离心15 min；弃掉上清加1 ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，7 500 min 4℃离心5 min；弃掉上清，空气干燥RNA沉淀10 min；用适量焦磷酸二乙酯(DEPC)处理过的水溶解PNA。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的质量。测定RNA 纯度、浓度及完整性。以总RNA为模板，经逆转录得到cDNA。 RTPCR RTPCR总反应体系25 μl。用磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作内参照，将PCR Mix混匀后进行扩增。CK6预变性94℃ 5 min；PCR扩增（35个循环）94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s；延伸72℃ 7 min。CK18预变性94℃ 5 min；PCR扩增（35个循环）94℃ 30 s，72℃ 1 min；延伸72℃ 7 min。GAPDH预变性94℃ 5 min；PCR扩增（30个循环）94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s；延伸72℃ 7 min。上、下游引物见表1，反应体系见表2。 结果观察 PCR产物在加溴化乙锭的%琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶图像分析系统上观察结果并拍照。作为内参引物的GAPDH片段长度为230 bp，CK6、CK18基因扩增片段分别为164和154 bp。若在相应位置出现DNA条带，则CK6或CK18 mRNA表达阳性，淋巴结存在微转移〔6〕 表2 聚合酶链反应体系（略） 统计学处理 采用χ2检验，以实验数据的95%可信区间为正常值范围。数据处理通过统计软件完成。 2 结果 各组CK6和CK18阳性表达比较 60例正常胃黏膜中无CK6、CK18的表达；胃癌组织中CK6的阳性率为%（13/60），CK18的阳性率为%（38/60），CK18显著高于CK6的表达;常规病 理学 检查未发现转移的180枚淋巴结(PN0)中，经RTPCR方法检测，发现有22枚淋巴结CK6 mRNA表达阳性，阳性率为%，有128枚淋巴结CK18 mRNA表达阳性，阳性率为%；其差异具有统计学意义(P＜)。图1。 M:标志物 C:肿瘤组织 L:淋巴结 图1 CK6和CK18在胃癌组织及淋巴结中