外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响临床医学.docVIP

外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响临床医学 1 1 材料与方法 2 2 结果 3 3 讨论 4 文2：宫颈癌组织抑癌基因P33ING1及P53表达的临床意义 5 1材料和方法 5 参考文摘引言： 7 原创性声明（模板） 9 文章致谢（模板） 9 正文 外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响临床医学 文1：外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响临床医学 脑细胞凋亡与缺血性脑损伤密切相关。近年来研究发现，吸烟或烟雾暴露可诱导脑细胞发生凋亡，。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是很有临床应用价值的一种神经营养因子，其神经活性广泛，能保护神经元，促进神经生长，具有抗缺血性脑损伤的作用。目前国内外尚无关于外源性bFGF对吸烟所致脑细胞凋亡影响的报道。本实验将外源性bFGF应用于吸烟大鼠，通过对大鼠脑细胞凋亡及p53蛋白表达进行比较，探讨外源性bFGF对吸烟所致脑细胞凋亡的作用及其机制，为临床应用bFGF提供理论依据。 1 材料与方法 动物吸烟模型的建立及分组 健康成年雄性Wister大鼠40只（由 中国 医科大学实验动物中心提供），体重200～250 g，随机平均分成4组：（1）正常对照组；（2）长期大量吸烟组：燃烧香烟10支×2次/d，共90 d ；（3）短期大量吸烟组：燃烧香烟10支×2次/d，共45 d；（3）长期大量吸烟+bFGF组：吸烟量及时间与（2）组相同，于吸烟最后15 d腹腔内注射bFGF。各吸烟组均用尼古丁含量为 mg/支的市售某品牌香烟，置于80 cm×60 cm×40 cm大小的自制烟熏箱中，实验期间各组大鼠饲养条件一致。 标本制备 各组大鼠用10%水合氯醛麻醉后，开胸经心腔快速灌注肝素化生理盐水250 ml，用4%多聚甲醛磷酸缓冲液（4℃， mol/L PBS配置，），灌注固定30 min。断头取脑，置于4℃相同浓度的多聚甲醛缓冲液中固定过夜，常规石蜡包埋，连续冠状切片，片厚约5 μm。相邻切片分别行TUNEL及免疫组化染色。 TUNEL法检测细胞凋亡 凋亡检测试剂盒购自武汉博士德生物试剂公司。切片依次经二甲苯脱蜡，剃度酒精水化，蛋白酶K 20 μg/ml 37℃消化15 min，TBS（）洗5 min，3次。滴加TUNEL反应液（TdT 1 μl，DIGdUTP 1 μl，18 μl标记缓冲液，20 μl/片），37℃孵育2 h。TBS洗2 min，3次;加生牡素化地高辛抗体，37℃孵育30 min，TBS洗2 min，3次;DAB显色，苏木素复染。TBS洗。树胶封片。阴性对照TUNEL反应液中去掉了TdT酶，其余操作同上。 免疫组化染色 p53多克隆抗体购自武汉博士德生物试剂公司。切片常规脱蜡入水。%过氧化氢37℃作用10 min灭活内源性酶。 mol/L柠檬酸缓冲液（pH ）高压修复2 min左右，冷却至室温，滴加5%BSA封闭液37℃，20 min。加p53抗体，4℃过夜。PBS洗5 min，3次;加生物素化羊抗兔IgG 37℃孵育 20 min，PBS洗2 min，3次。滴加SABC 37℃，20 min。PBS洗3 min，5次。DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，其余操作同上。 图像分析与数据处理 用显微成像系统采集图片， 计算 并分析阳性细胞平均灰度值，数据用软件进行单因素方差分析，各组间比较用两样本均数比较的t检验。 2 结果 大鼠脑细胞凋亡 见表1。镜下凋亡细胞TUNEL阳性染色为褐色圆形或椭圆形实心小体。正常对照组偶有散在的凋亡细胞。各吸烟组与正常对照组相比，凋亡细胞明显增多（P＜）。长期大量吸烟组凋亡细胞较短期大量吸烟组明显增多（P＜）。bFGF治疗组凋亡细胞较两单纯吸烟组明显减少，但仍较正常对照组明显增多（P＜）。凋亡细胞分布以海马区最多，皮质及其他脑区亦可见到。 p53 蛋白表达 见表1。光镜下可见核为蓝色、胞浆为棕色的p53阳性细胞。正常对照组有少量阳性表达，各吸烟组p53阳性细胞较正常对照组明显增多（P＜）。长期大量吸烟组p53表达较短期大量吸烟组明显增多（P＜）。bFGF治疗组p53表达较两单纯吸烟组明显减少，但仍较正常对照组明显增多（P＜）。p53阳性细胞分布以海马区最多，皮质及其他脑区亦可见到，与凋亡细胞分布一致。 表1 吸烟大鼠脑内凋亡细胞及p53阳性细胞平均灰度（略） 与正常对照组比较：1)P＜，与长期大量吸烟组比较：2