重组Psilencer10U6siRNAstat3质粒对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞的影响临床医学.docVIP

重组Psilencer10U6siRNAstat3质粒对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞的影响临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：重组Psilencer10U6siRNAstat3质粒对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞的影响临床医学 1 1 材料与方法 2 2 结果 3 3 讨论 4 文2：减毒沙门氏菌携带siRNASTAT3质粒对小鼠前列腺移植癌的治疗作用临床医学 5 1 材料与方法 6 2 结 果 10 3 讨 论 12 参考文摘引言： 15 原创性声明（模板） 16 文章致谢（模板） 17 正文 重组Psilencer10U6siRNAstat3质粒对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞的影响临床医学 文1：重组Psilencer10U6siRNAstat3质粒对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞的影响临床医学 血管平滑肌细胞(VSMC)向内膜层的迁移和增殖是近年来血管增殖性疾病的研究热点和防治难点〔1〕。研究发现，平滑肌细胞表型的改变（由收缩型变成分泌型）使得平滑肌细胞获得了增殖和迁移的能力，造成了移植或损伤后血管内膜的增生，从而造成血管的再狭窄〔2〕。有观点认为，平滑肌细胞的增殖和转移是由细胞内信号传导途径调节的〔3，4〕。转录信号传导子及激活子通路（STAT3）代表一条从膜到核的信号传导系统,激活后可以选择性地激活其底物——STAT,并相应的激活Cyclin D1、BclxL及Cmyc等下游靶基因，调节细胞增殖、分化及凋亡，可能在促进VSMC增殖进程中起重要的作用〔5〕 U6siRNAstat3是通过RNA干扰技术建立的能够抑制STAT3表达的重组质粒，能使STAT3基因片段的转录、翻译过程受到抑制，从而阻断其对下游靶基因的作用，由此达到对细胞增殖的控制。本实验将该质粒通过脂质体转染的方法作用于体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞（MCs）,应用相差显微镜、MTT比色法等技术手段对其观察，希望通过研究STAT信号通路与MCs的关系,为揭示血管新生内膜形成、血管重塑等病理机制提供新的思路和方法。 1 材料与方法 试剂 Lipofectamine2000（Invitrogen）、Trizol（Invitrogen）、胰蛋白酶(美国GIBCObrL公司)、胎牛血清(BSA,美国HyClone公司) 、DMEM培养基、MTT、DMSO。 大鼠原代MCs的培养与分离 应用组织块培养方法培养原代MCs：大鼠150～180 g，脱臼致死，固定。消毒胸腹部，剪切开胸腹部，分离胸腹主动脉并放入盛有Hank′s液的细胞培养皿中，眼科镊去除血凝块和血管外膜层。放入另一含20%胎牛血清Hank′s液的细胞培养皿中，剪开血管腔，以眼科弯镊轻轻擦拭去掉内膜层内皮细胞。放入另一含20%胎牛血清的DMEM中，用眼科弯剪剪碎血管组织至1 mm，把组织块转入玻璃培养皿中，均匀贴壁，组织块的间距为 cm。盖好瓶盖，瓶底朝上，向瓶内注入适量培养液，于37℃孵箱内放置4～5 h，使组织块干涸，并与瓶底贴附。将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续静置3～5 d。待有细胞从组织块周围游离出后换液。待大部分组织块长出细胞晕，并与相邻细胞晕接触时就可以传代，实验用第5代细胞。分为对照组、空质粒组和重组质粒（U6siRNAstat3）组。 MTT比色法检测重组质粒对MCs增殖率的影响 取对数生长期MCs，胰酶消化后，无血清培养基调制细胞浓度为2×105/ml接种于96孔平底培养板，每孔100 μl (2×104/孔)。将其分为3组，分别为对照组、空质粒组、重组质粒组。对照组不加质粒和脂质体，空质粒组每孔添加空质粒 μg、质粒 μl，重组质粒组每孔添加重组Psilencer U6siRNAstat3质粒 μg、脂质体 μl，均培养至48 h及72 h，在相差显微镜下观察拍照后，各孔加入浓度为5 g/L MTT(用PBS新鲜配制)20 μl，温箱孵育4 h，轻轻吸去上清，每孔加入DMSO 100 μl，震荡10 min，用酶标仪检测各孔的吸光度值（OD570）， 计算 细胞的生长抑制率。 细胞生长抑制率（%）=（1-实验组/对照组）×100% MCs相差显微镜观察 转染完成后相差显微镜下观察48 h及72 h各组MCs形态。并比较其差别。 统计学处理 组间比较采用t检验。 2 结果 MCs相差显微镜观察结果 48 h后对照组细胞贴壁生长，状况良好，呈梭形、不规则三角形或扇形，核仁清晰，可见核分裂相，细胞折光性好，增殖旺盛，细胞间相互融合，呈“铺路石”样；重组质粒组细胞生长缓慢，可见卵圆形，细胞皱缩；部分细胞失