银杏川芎制剂与骨髓基质细胞联合治疗局灶性脑缺血的实验研究临床医学.docVIP

银杏川芎制剂与骨髓基质细胞联合治疗局灶性脑缺血的实验研究临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：银杏川芎制剂与骨髓基质细胞联合治疗局灶性脑缺血的实验研究临床医学 1 1 材料与方法 2 2 结果 4 3 讨论 4 文2：银杏叶提取物对大鼠局灶性脑缺血的保护作用 5 1 材料 6 2 方法 7 3 结果 8 4 讨论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 11 正文 银杏川芎制剂与骨髓基质细胞联合治疗局灶性脑缺血的实验研究临床医学 文1：银杏川芎制剂与骨髓基质细胞联合治疗局灶性脑缺血的实验研究临床医学 以往研究证实，骨髓基质细胞(MSCs)静脉移植治疗大鼠局灶性脑缺血疗效确实，可降低脑梗死体积，促进神经功能障碍的恢复〔1〕，静脉移植MSCs最佳时间窗是在缺血发生后3～24 h，临床在最佳时间窗内应用MSCs治疗局灶性脑缺血可达到理想效果。川芎活性成分川芎嗪和阿魏酸具有扩张血管，抑制血小板活性作用〔2〕，银杏活性成分为黄酮类和萜内脂类，具有扩张血管、增加脑血流、抗氧化、抗自由基等脑保护作用〔3〕。本研究采用复方中药银杏、川芎制剂联合MSCs治疗大鼠局灶性脑缺血，探讨银杏、川芎制剂是否可以使MSCs治疗最佳时间窗延后，是否能促进MSCs在脑病灶内分布、分化。 1 材料与方法 动物 3月龄SpragueDawley(SD)雄性大鼠30只，体重230～280 g，由吉林大学新民校区实验动物中心提供。 方法 试剂 MSCs：Ori Cell TM间充质干细胞冻存标本(广州赛业生物科技有限公司)，复苏后调整细胞浓度3×106。复方中药制备：银杏叶提取物、川芎嗪按20∶5(5 mg/ml)制成无菌液(长春长云生物制药股份有限公司)。brdU(5溴脱氧尿核苷5bromo2deoxyuridine)美国Sigma公司。brdU〔bromodeoxyuridine 溴代脱氧尿(嘧啶核)苷〕、GFAP(胶质纤维酸性蛋白)及一抗，SABCFITC均购自武汉博士德生物工程公司(博士德公司分装) 模型制备 参照Zea Longa法制备局灶性脑缺血再灌注大鼠模型。切开一侧颈部皮肤，手术显微镜下分离右颈总动脉、颈外动脉及其分支动脉，接近颅底部位电灼后结扎切断颈外动脉，分离颈内动脉至鼓泡处，并暴露出翼腭动脉。在颈内动脉远端备线并放置动脉夹，在近心端距颈总动脉分叉 cm处用7号注射器针穿刺颈总动脉，注入少许肝素钠盐水，插入40尼龙线23～25 mm，进入规定深度遇轻微阻力后停止，扎紧备线，栓线在皮肤外留有1 cm长线头，缝合皮肤。MCA阻断后2 h将栓线撤至颈总动脉，麻醉苏醒后大鼠左侧前肢体瘫、走路向一侧偏斜、右眼睑低垂为局灶性脑缺血再灌注制备成功模型。随机分为对照组、MSCs组、MSCs+中药组，每组10只。 给药方法 各组大鼠在规定时限前3 d开始腹腔内注射brdU(50 mg/kg)，每日2次，共6次。制备局灶性脑缺血再灌注模型后2 h，对照组静脉注射PBS 2 ml，MSCs 组尾静脉注入MSCs 2 ml。MSCs +中药组于制备局灶性脑缺血再灌注模型后5 h静脉注入银杏、川芎制剂2 ml(5 mg/ml)，每日2次，48 h尾静脉注入MSCs 2 ml。 行为学检测 治疗后5、7、14 d用姿势反射实验和肢体不对称应用实验〔4,5〕评价大鼠神经功能障碍严重程度。肢体不对称应用实验：用于测试的器械为一直径18 cm、高30 cm透明的玻璃圆桶，正常大鼠在圆桶中会不时站立,用双侧前肢交替或同时触及桶壁,应用双侧前肢的频率应该相等。有缺血性脑损伤的大鼠偏瘫侧肢体应用较少，观察并记录双侧前肢的应用情况，对每只大鼠每次记录20次活动。以肢体应用的百分率 计算 最后得分，得分=(R-L)/(R+L+B)×100%，R:右侧前肢(健侧)独立应用次数;L:左侧前肢(患侧)独立应用次数;B:双前肢同时应用次数。姿势反射实验:距地面1 m提起鼠尾,观察其前肢屈曲情况，每次每只大鼠记录20次活动,评分标准：0分(正常)，双前肢完全伸展；1分(轻度异常)，左前肢贴向前胸,右前肢伸展；2分(重度异常):左前肢贴向前胸，上半身卷曲。每只大鼠每次的最后得分为20次评分的平均分。 免疫组织化学检测 各组大鼠开胸，行内固定，以视交叉和其后4 mm处两点行冠状切片，再次甲醛固定，经酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。使用双标免疫组化染色法确定由骨髓基质来源的细胞，按照SABCFITC检测试剂盒指导使用。切片用Zeiss LSM510激光扫描共聚焦显微镜检测切片，细胞核绿色，细胞质呈玫瑰红。 统计学分析 所有数据以x±s