齐墩果酸对K562细胞baxbclxLmRNA表达的影响临床医学.docVIP

齐墩果酸对K562细胞baxbclxLmRNA表达的影响临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：齐墩果酸对K562细胞baxbclxLmRNA表达的影响临床医学 1 1 材料与方法 2 2 结 果 4 3 讨 论 4 文2：维生素K2对K562细胞生长抑制作用的实验研究医学 5 1 材料与方法 5 2 结 果 7 3 讨 论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 12 正文 齐墩果酸对K562细胞baxbclxLmRNA表达的影响临床医学 文1：齐墩果酸对K562细胞baxbclxLmRNA表达的影响临床医学 近年来国内外研究表明，齐墩果酸（Oleanolic Acid，OA）具有抑制HL60细胞凋亡作用〔1〕，但有关OA对慢性粒细胞白血病细胞作用及其确切机制尚不清楚。本实验通过观察OA对慢性粒细胞白血病K562细胞bclxL和bax基因表达的影响，初步探讨OA诱导K562细胞凋亡的机制。 1 材料与方法 药品与主要试剂 K562细胞株购自 中国 科学 院上海细胞所；RPMI1640、胎牛血清均为 Hyclone公司产品；OA对照品购自中国药品生物制品检定所，分子式C30H48O3，分子量；二甲基亚砜（DMSO）为中科院生物医学工程所产品；DEPC、DNA Marker及RTPCR试剂盒为大连宝生物产品,青霉素和链霉素购于北京索莱宝科技有限公司。 方法 药物配制 OA对照品溶于DMSO中，配制成80 mmol/L的储备液,-20℃储存，使用时用含10%胎牛血清的1640培养液配制成终浓度为800 μmol/L的工作液。 细胞培养及分组 K562细胞常规培养于含10%小牛血清，青霉素、链霉素各100 U/ml的RPMI1640培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱传代培养。根据培养时间的不同分为48 h和72 h处理组，每组又设空白对照组（RPMI1640培养基），DMSO溶媒对照组，根据本课题组前期实验结果〔3〕选择OA处理组浓度为80 μmol/L。每次实验重复3次。 细胞形态学观察 倒置显微镜下观察OA作用不同时间段时K562细胞的生长变化，观察细胞染色质和胞浆的变化。 RTPCR反应 采用Primer 软件设计bax、bclxL及内参βactin基因PCR引物，引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成，引物序列及扩增片段大小如下： bax上游 5′GGATGCGTCCACCAAGAA3′，下游 5′CACTGTGACCTGCTCCAGAA3′，扩增序列长度为438 bp ； bclxL上游5′CTGAATCGGAGATGGAGACC3′，下游5′AGTGAGCCCAGCAGAACC3′，扩增序列长度为376 bp；内参βactin 基因上游 5′CGGGAAATCGTGCGTGACAT3′，下游 5′GAACTTTGGGGGATGCTGCTCGC3′，扩增序列长度为 712 bp。 取对数生长期细胞，培养48、72 h后，分别收集对照组和实验组细胞，采用Trizol试剂提取样本总RNA，紫外分光光度计测 OD260/ OD280， 计算 RNA浓度及纯度。RNA的反转录操作步骤按试剂盒说明进行。将反转录产物cDNA于94℃预变性4 min，94℃变性30 s，退火30 s，（bax和bclxL的退火温度分别为℃、℃），72℃延伸40 s，循环35次，最后72℃延伸10 min。PCR反应后取10 μl产物加样，在%琼脂糖凝胶上80～120 V 电泳，EB溶液中染色，紫外透射凝胶图像分析仪上观察电泳结果并照相，计算目的基因与βactin灰度比值，进行目的基因表达的半定量分析。 统计学处理 实验数据以x±s表示，组间比较采用t检验，所有数据采用医学统计学软件处理。 2 结 果 细胞形态学改变 随着处理时间的增加细胞增殖明显受抑制，有明显的时间依赖性，细胞形状不规则，部分出现膜皱缩、凋亡小体等凋亡标志。而对照组细胞大小均一，无明显的增殖抑制和形态学改变。见图1。 RTPCR结果 K562细胞的bax和bclxL表达分别见图2，半定量分析数值见表1。与空白对照组比较：DMSO组bax和bclxL mRNA表达量无明显变化（P＞）；OA处理组与以上两处理组比较bax和bclxL mRNA各值表达量分别显著升高和降低（P＜）。表1 不同时间、不同组bax、bclxL mRNA含量比较(略) 3 讨 论 目前研究表明，药物 治疗 肿瘤主要是引起肿瘤细胞凋亡。本研究发现，OA作用K562细胞48 h后，细胞数量减少，并