CalphostinC抑制酶修饰低密度脂蛋白诱导的内皮单核细胞黏附临床医学.docVIP

CalphostinC抑制酶修饰低密度脂蛋白诱导的内皮单核细胞黏附临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：CalphostinC抑制酶修饰低密度脂蛋白诱导的内皮单核细胞黏附临床医学 1 1 材料与方法 2 2 结 果 5 3 讨 论 6 文2：雷公藤红素阻断全反式维甲酸导致的白血病细胞与内皮细胞黏附临床医学 8 1 材料与方法 9 2 结果 11 3 讨论 13 参考文摘引言： 15 原创性声明（模板） 17 文章致谢（模板） 17 正文 CalphostinC抑制酶修饰低密度脂蛋白诱导的内皮单核细胞黏附临床医学 文1：CalphostinC抑制酶修饰低密度脂蛋白诱导的内皮单核细胞黏附临床医学 单核细胞与血管内皮细胞、平滑肌细胞的黏附是动脉粥样硬化性心脑血管病的重要早期事件〔1〕，探讨病理状态下细胞与细胞间的黏附机制，并进而采取相应的干预措施，尤其是早期的药物干预，将会有效地预防该类疾病的发生。为此，本研究拟在课题组前期高脂血症影响内皮功能、促进脂纹和斑块形成的基础上〔2〕，以酶修饰的低密度脂蛋白(ELDL)处理ECV304人脐静脉内皮细胞，观察其黏附能力及相关指标，细胞间黏附分子1(ICAM1)、抑制性蛋白κBα(IκBα)和蛋白激酶C(PKC)的改变，并进而以PKC的特异性抑制剂Calphostin C进行相应干预，试图为黏附干预药物的体外研究奠定基础。 1 材料与方法 材料与试剂 THP1单核细胞和ECV304脐静脉内皮细胞(购自 中国 科学 院上海细胞生物学研究所细胞库)；Calphostin C(购自Biomol公司)。总RNA提取试剂盒TRIzol(购自上海Sangon公司)；ImPromIITM Revee Tracriptase、PepTag○RNonRadioactive PKC Assay Kit 和BCATM Protein Assay Kit(购自Promega)；MasterMix一管便捷式PCR扩增试剂盒(购自北京天为时代)；所有引物(由上海生工生物工程服务有限公司合成)；IκBα和ICAM1一抗，Western印迹Luminol Reagent(购自Santa Cruz)；辣根过氧化物酶标记二抗(购自武汉博士德生物工程有限公司)；其他试剂均为进口或国产分析纯。 低密度脂蛋白(LDL)的分离、酶修饰及鉴定 参考 文献 〔3〕的方法制备ELDL。取新鲜人血浆100～200 ml，加入PDB以防腐抗氧化。置超速离心机作序列超速离心。提纯的LDL在含200 μmol/L EDTA的磷酸缓冲液(PBS)液中透析48 h后，加入胰蛋白酶( μg/ml)和胆固醇脂酶(40 μg/ml)共孵育48h后，获得ELDL。BCA法蛋白定量，鉴定后过滤除菌，调蛋白浓度至1 g/L，4℃保存，1 w内使用。 实验分组 本研究分为两个部分，首先以ELDL浓度梯度(0、5、10、20、40 μg/ml)处理ECV304内皮细胞8 h。在观察到内皮细胞黏附功能和胞膜PKC活性的变化后，为了进一步明确ELDL诱导黏附的可能机制以及PKC和黏附的关系，遂以PKC的特异性抑制剂Calphostin C 处理荷载ELDL的ECV304内皮细胞。分组情况：①25 μg/ml ELDL +10 μl DMSO孵育细胞8 h；②25 μg/ml ELDL+25 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h；③25 μg/ml ELDL+50 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h；④25 μg/ml ELDL+100 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h；⑤25 μg/ml ELDL+200 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h；⑥25 μg/ml ELDL+400 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h。加入处理因素后每组细胞均在距20 W Philip荧光灯10 cm处照射大约30 min，以激活CalphostinC的药物活性。 细胞黏附实验 参考文献〔4〕并加以改进。向生长于24孔板并融合至80%的ECV304细胞中分别加入上述处理因素培养8 h后，加入4×106个/mlTHP1单核细胞悬液800 μl/孔，37 ℃孵育30 min，吸弃培养基，预热PBS洗2次去除未黏附细胞，4%多聚甲醛固定细胞，显微镜 计算 机图像分析系统计数黏附细胞，方法为每个孔分别计数上、中、下、左、右每个视野的ECV304和THP1细胞数，5个视野单核细胞数/内皮细胞平均后即得到各个孔每个视野每个ECV304内皮细胞黏附