第一章生物化学检阳测技术.pptVIP

火焰光度法——等离子体发射光谱法 原子吸收分光光度法 糖蛋白染色 过碘酸-Schiff试剂 阿尔山蓝染色 脂蛋白染色 油红O染色 苏丹黑B 核酸的染色 将凝胶先用三氯乙酸、甲酸-乙酸混合液、氯化高汞、乙酸、乙酸镧等固定，或者将有关染料与上述溶液配在一起，同时固定与染色。有的染色液可同时染DNA及RNA，如stains-all、 溴乙锭荧光染料等，也有RNA，DNA各自特殊的染色法。 核酸的染色 RNA染色法 焦宁：其对RNA染色效果好，灵敏度高。脱色后凝胶本底颜色浅而RNA 色带稳定，抗光且不易褪色。此染料最适浓度为0.5%。低于0.5%则RNA色带较浅；高于0.5% 也并不能增加对RNA染色效果。 甲苯胺蓝O：其最适浓度为0.7%，染色效果较焦宁Y稍差些。 次甲基蓝：染色效果不如焦宁Y和甲苯胺蓝O，检出灵敏度较差，一般 在5μg以上；染色后RNA条带宽，且不稳定，时间长，易褪色。但次甲基蓝易得到，溶解性 能好，所以较常用。 吖啶橙：染色效果不太理想，本底颜色深，不易脱掉，但能区别单链或双链核酸(DN A，RNA)，对双链核酸显绿色荧光(530nm)，对单链核酸显红色荧光(640nm)。 核酸的染色 RNA染色法 荧光染料溴乙锭（简称EB）：可用于观察琼 脂糖电泳中的RNA、DNA带。EB能插入核酸分子中碱基对之间，使DNA和RNA在紫外灯下显示较强的荧光。 如将已染色的凝胶浸泡在1mmol/L MgSO４溶液中1h，可以降低未结合的EB引起的背景荧光，对检测极少量的DNA有利。 EB染料具有下列优点：操作简单，凝胶可用1-0.5μg/mL的EB染色，染色时间取决于凝胶浓度，低于1%琼脂糖的凝胶、染15min即可。多余的EB不干扰在紫外灯下检测荧光；染色后不会使核酸断裂，因此可将染料直接加到核酸样品中，以便随时用紫外灯追踪检查；灵敏度高，对1ng RNA，DNA均可显色。 EB染料是一种强烈的诱变剂，操作时应注意防护，应戴上聚乙烯手套。 核酸的染色 DNA染色法 除了EB染色最常用外，还有以下几种方法。 甲基绿：一般将0.25%甲基绿溶于0.2mol/L pH4.1的乙酯缓冲液中，用氯仿抽提至无紫色，将含DNA的凝胶浸入，室温下染色1h即可显色，此法适用于检测天然DNA。  Feulgen染色：用此法染色前，应将凝胶用1mol/L HCl固定，然后用Schiff试剂在室温下染色，这是组织化学中鉴定DNA的方法。 第二节 光学检测技术 基于物质光化学性质而建立起来的分析方法称之为光化学分析法。 分为:光谱分析法和非光谱分析法。 光谱光度分析技术是利用化学物质具有的发射光、吸收光或散射光的光谱特征来分析其性质、结构和含量的方法，也叫分光光度技术。 光的互补：蓝?? 黄 一、紫外—可见光分光光度技术 利用化学物质在紫外、可见光区的分子吸收光谱，对物质作定性、定量和结构分析的方法。 物质的颜色来自物质对光的选择性吸收。各种不同的物资都具有其各自的吸收光谱。 当某单色光通过均匀溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度、入射光强度及溶液的厚度成正比，描述其关系的方程就是比色原理——郎伯-比耳定律。 T = I/I0， A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I。 入射光强度为I0，透射光强度为I，T为透光度。 透光度的负对数称为吸光度。 A = KLC A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度。 二、分光光度计的结构原理 最常用的是可见分光光度计和紫外-可见光分光光度计 光源 单色器 样品 吸收池 检测器 信号指示系统 五大部份 结构： （一）光源 光源定义： 指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变化。 光源种类： 可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯。 紫外光光度计常用氢灯作为光源。 （二）单色器 定义： 将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分 光系统或单色器。 种类： 滤光片 棱镜 光栅 （三）比色杯 又称为吸收池或比色皿 材料： 常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成 （五）信号指示系统 （四）检测器 检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号 放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。 是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的 装置。 三、分光光度计的操作方法 （一）分光光度计的基本操作 以721-A型分光光度计为例，其基本的操作步骤为： 1.开721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子