抗体纯化课件.ppt

抗体的纯化;一 纯化目的;二 纯化原理;盐析法原理;离子交换层析原理;免疫亲合层析原理; 力、范德华力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异性吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来；然后恰当的改变起始缓冲液的PH值或增强离子强度或加入抑制剂等因子，即可以把物质S从固相载体上解离下来，通过这一操作程序就可以把有效成分与杂质分离开来。;8;基质的选择; 4.大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合； 5.适当的多孔性。具体要求须根据分离物的性质而定。 一般的亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、胶联琼脂糖以及多孔玻璃珠。目前用的最多的是琼脂糖珠。;;配体的选择; b.抗原柱纯化;三 纯化步骤;3.2 步骤 3.2.1抗原透析 （仅用于融合蛋白） 3.2.1.1 准备好透析夹,并在上面贴上标签 3.2.1.2 剪取适当长的透析袋（1cm透析袋约可容纳3ml的溶液）, PBS洗三次3次 3.2.1.3 透析夹夹好透析膜的一端,加入抗原,夹好另一端 3.2.1.4 配制新鲜的透析液,并将透析膜置于其中, 4℃ 6小时或者过夜,重复三次;(注意:透析中应经常观察,一是防止透析袋中的蛋白发生沉淀,二是防止透析夹上的标签脱落) ;3.2.2连接 3.2.2.1 准备好 1mMol/L HCl，并放入4℃预冷 3.2.2.2 计算所需的CNBr-activated Sepharose4B的量 （1克冻干的粉末可以活化成3.5ml的beads，1mlbeads吸附5-10mg蛋白）； 3.2.2.3 将称量好的beads放入预冷的HCl中活化，在4℃放置15min  3.2.2.4 剪好滤纸，装好抽滤装置，先用预冷的HCl冲洗抽滤装置  3.2.2.5 将beads加入抽滤装置中，1mlbeads用200ml HCl 抽滤 ;3.2.2.6 将抽滤后beads放在一干净的PE 手套上，与透析好的抗原一起转移到15ml离心管中，封口膜封口，孵育，室温2小时或4℃过夜 3.2.2.7 将结合了抗原的beads转移到纯化管中，加入couping Buffer15ml冲洗 3.2.2.8 加入封闭液3ml，孵育，室温2小时或4℃过夜  3.2.2.9 PBS冲洗3次 ;3.2.3 纯化 3.2.3.1 将连接抗原的beads和血清一起孵育，室温2小时或4℃过夜 3.2.3.2 让血清流出纯化管，收集 3.2.3.3 用10ml PBS冲洗beads 3.2.3.4 在EP管中事先加入50ul中和液 3.2.3.5 加入洗脱液，每次1ml，分管收集 3.2.3.6 同时用CBB溶液检测收集的抗体浓度，100ulCBB溶液加入3.3ul收集液 ;3.2.3.7 将浓度高的收集液集中，于4℃暂时保存 3.2.3.8 加入0.01M Tris (PH7.5)15ml 3.2.3.9 加入15ml PBS冲洗 3.2.3.10 加入2ml含0.02%叠氮钠的PBS储存beads，4℃ 3.3 抗体长期保存条件: 50% 甘油+0.1%叠氮钠;