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仪器分析实验课件 第一页，共13页 可乐、咖啡、茶叶中咖啡因的高效液相色谱分析 一、目的要求 1、理解反相色谱的原理和应用； 2、掌握标准曲线定量法。 第二页，共13页 二、原理 咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7—三甲基黄嘌吟，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。 咖啡中含咖啡因约为1.2%~1.8%，茶叶中约含2.0%~4.7%。可乐饮料、APC药片等中均含咖啡因。 分子式为C8H10O2N4，结构式为： 第三页，共13页 样品在碱性条件下，用氯仿定量提取，采用Econosphere C18反相液相色谱柱进行分离，以紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做工作曲线，再根据样品中的咖啡因峰面积，由工作曲线算出其浓度。 第四页，共13页 三、仪器与试剂 仪器? Agilent 1100液相色谱仪（美国），Econosphere C18反相色谱柱，l 0cm*4. 6cm；平头微量注射器。 试剂? 1、甲醇（色谱纯）；二次蒸馏水；氯仿（A. R.）；lmol/L NaOH；NaCl（A. R.）；Na2SO4 (A. R.)；咖啡因(A. R.)；可口可乐（l.25L瓶装）；雀巢咖啡；茶叶。 2. 咖啡因标准贮备溶液 第五页，共13页 四、实验步骤 1、按操作说明书使色谱仪正常工作，色谱条件为： 　　柱温：室温 　　流动相：甲醇／水 ＝ 60/40? 　　流动相流量：1.0mL/min 　　检测波长：275nm 2、咖啡因标准系列溶液配制：分别用吸量管吸取咖啡因标准贮备液于五只10mL容量瓶中，用氯仿定容至刻度，浓度分别为40、60、80、100、120mg/L。 第六页，共13页 3、样品处理如下： （1）将约100mL可口可乐置于一250mL洁净、干燥的烧杯中，剧烈搅拌30min或用超声波脱气5min，以赶尽可乐中二氧化碳。 （2）准确称取0.25g咖啡，用蒸馏水溶解，定量转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀。 （3）准确称取0.30g茶叶，用30mL蒸馏水煮沸l0min，冷却后，将上层清液转移至100mL容量瓶中，并按此步骤再重复二次，最后用蒸馏水定容至刻度。 将上述三份样品溶液分别进行干过滤（即用干漏斗、干滤纸过滤），弃去前过滤液，取后面的过滤液。 第七页，共13页 分别吸取上述三份样品滤液25.00mL于125mL分液漏斗中，加入1.0mL饱和氯化钠溶液，1mL lmol/L NaOH溶液，然后用20mL氯仿分三次萃取（10mL、5mL、5mL）。将氯仿提取液分离后经过装有无水硫酸钠小漏斗（在小漏斗的颈部放一团脱脂棉，上面铺一层无水硫酸钠）脱水，过滤于25mL容量瓶中，最后用少量氯仿多次洗涤无水硫酸钠小漏斗，将洗涤液合并至容量瓶中，定容至刻度。 第八页，共13页 4、绘制工作曲线：待液相色谱仪基线平直后，分别注入咖啡因标准系列溶液10μL重复二次，要求二次所得的咖啡因色谱峰面积基本一致，否则，继续进样，直至每次进样色谱峰面积重复，记下峰面积和保留时间。 5、样品测定：分别注入样品溶液10μL，根据保留时间确定样品中咖啡因色谱峰的位置，再重复二次，记下咖啡因色谱峰面积。 6、实验结束后，按要求关好仪器。 第九页，共13页 五、结果处理 1、根据咖啡因标准系列溶液的色谱图，绘制咖啡因峰面积与其浓度的关系曲线。 2、根据样品中咖啡因色谱峰的峰面积，由工作曲线计算可口可乐、咖啡、茶叶中咖啡因含量（分别用mg/L、mg/g和mg/g表示）。 第十页，共13页 AR 化学纯