realtime-QPCR实验指导分析和总结.pdfVIP

实时荧光定量 PCR 实时荧光定量 PCR，简称 RT-QPCR, 属于 Q-PCR 的一种， 目前该技术已得 到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、 SNP 分析等。荧 光定量 PCR 最常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR Green Ⅰ的非特异性方法和 Taqman 水解探针的特异性方法。 本视频使用 LightCycler? 480 SYBR Green I Master 试剂盒介绍 SYBR Green I 的非特异性方法。 SYBR Green I 是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波 长的荧光染料，可与所有的各种序列的双链 DNA 分子结合。在游离状态下， SYBR Green I 发出微弱的荧光，但一旦与双链 DNA 结合，嵌入至 dsDNA ，荧 光大大增强。 因此，SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关， PCR 扩增 不同时期中， dsDNA 含量不同， SYBR Green I 荧光信号强度不同。可以根据荧 光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量， 并可根据对照进行相关的计算 和分析。 实验前准备 实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材。 试剂包括：特异性 PCR 引物，新鲜提取备用的总 RNA 。 使用的试剂盒有：用于合成 cDNA 第一链的罗氏试剂盒 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit ，包含了 cDNA 反应所需要的所有实验组分以及相关 的正对照反应组分。 配套 LightCycler? 480 使用的试剂盒 LightCycler? 480 SYBR Green I Master ， 包含了 PCR 所需的各种实验组分，如 1 号管中包含热启动 Taq DNA Polymerase 及反应缓冲液， dNTP mix ，SYBR Green I 染料和 MgCl 2 正式试验开始前，冰上解冻各个试剂及试剂盒组分，置于冰上待用。注意： SYBR Green I Master 需避光放置。 所需仪器与耗材有：罗氏 LightCycler? 480 全自动实时定量 PCR 仪以及配 套使用的 96 或 384 多孔板，透明封板膜等一次性耗材。 赛默飞公司提供的 Thermo Scientific Arktik PCR 仪、单道移液器、 Nunc 冰盒及 QSP 盒装吸头等。 接下来进入实验部分，本实验操作流程是：首先用新鲜提取的 RNA 反转 录合成 cDNA 第一链，然后进行实时荧光定量 PCR，其中包括： SYBR Green 反 应体系的配置； PCR程序设置；运行 PCR 实验，样品编辑和结果分析。 反转录反应 首先是反转录合成 cDNA 第一链： 实验操作时注意：所有 RNA 相关的操作均要佩戴手套，防止 RNase 污染。 相关操作严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。 按照体系配方在冰上的 Rnase free的灭菌 PCR 管中配置 Template primer mix， 总体系 13 μl，本实验是联合使用 anchored oligo dT 引物和随机六聚体引物进行 的反转录。先配置 NTC 对照，加入 9 号管水 10 μl、 6 号管的