高中生物知识点：血红蛋白的提取和分离.docVIP

高中生物知识点：血红蛋白的提取和分离 血红蛋白的提取和分离的定义 血红蛋白的提取和分离： 1、实验原理 蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。 （1）凝胶色谱法（分配色谱法）： ①原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。 ②凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 ③分离过程： 混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 ④作用： 分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。 （2）缓冲溶液 ①原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3—NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。 ②缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。 (3）凝胶电泳法： ①原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 ②分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 ③分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质—SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 2、实验步骤 （1）样品处理 ① 红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的l ①分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 ②透析 取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。 （3）纯化：调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质 （4）纯度鉴定——SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 血红蛋白的提取和分离的知识扩展 一、实验原理 蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。 （1）凝胶色谱法（分配色谱法）： ①原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。 ②凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 ③分离过程： 混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 ④作用： 分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。 （2）缓冲溶液 ①原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3—NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。 ②缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。 (3）凝胶电泳法： ①原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 ②分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 ③分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质—SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 二、实验步骤 （1）样品处理 ① 红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。 ②血红蛋白的释放 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。 注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。 （2）粗分离