western blot实验技术及常见问题探讨-珍藏版PPT参考幻灯片.pptVIP

暗室操作！ A液 B液 1 1 : 膜 混合 ECL工作液 滴加ECL工作液 显影、定影 *  在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。 * 另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺(luminol，氨基苯二酰一肼)并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。 * 凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD) 15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5.0 57-212 * 灌制分离胶 隔绝空气 灌好后一般室温放置30－40分钟 * 灌制积层胶 插入梳子 * 上样 Staking gel Separating gel * 过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在4度放置2－3天。配制30％丙烯酰胺储存液要过滤。 配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。 要根据温度调整TEMED的使用量。 水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平。 SDS胶制备注意事项 * 插梳子的时候要用力均匀，一次成型。 在上样前可20V恒压预电泳20分钟，可去除泳道中的杂质。 * 3 转膜 要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。 1 常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。 2 * 湿转系统 * 湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。另外用这种方法转移双向电泳中常规使用的大胶比较困难。 * 湿转操作步骤： 1.起胶：将凝胶从玻璃板中取出，切除积层胶及溴酚蓝下部的分离胶，剩下的含有目的蛋白的分离胶浸泡于转膜缓冲液中，防止胶凝固、变形。 2.润湿：准备2张Whatman 3#滤纸、1张NC膜，尺寸与凝胶大小相仿（滤纸与胶一样大，膜比胶大一些）， NC膜先放入水中3分钟，再放入转膜缓冲液中10分钟。（若用PVDF膜，应先在100%甲醇中浸泡，否则很难润湿。甲醇可反复利用。） * 3.三明治的制作：按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、1层Whatman 3#滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、1层Whatman 3#滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。 组装顺序：转膜夹黑色面（负极）－海绵垫－滤纸－胶－ 膜－滤纸－海绵垫－红色面（正极） 切记：每层之间用滴管/玻棒将其中的气泡全部赶出，绝不允许气泡存在！ * 4.转膜：将转移夹放入转移槽，加入4 ℃预冷的转膜缓冲液，将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。 * 转膜电流和时间: 一般转膜的电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。大片段的50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA，上述电流均能很好的把大部分蛋白转过去。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。 * 转膜的注意事项： 胶在负极，膜靠近正极； 转膜缓冲液一定要事先预冷，最好提前一天 配好放4 ℃ 冰箱； 滤纸不要大过膜，防止短路； 夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间 没有气泡存在，否则会导致转膜不完全； 注意一定要戴手套或用塑料镊子接触膜，因 为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会污 染膜； * 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时， 通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜 槽放置在冰浴中进行转膜。 * 半干转移系统 * 半干转移用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高