基因组DNA提取与PCR技术讲课文档.pptVIP

一、PCR的基本原理示意图 Flash演示 现在二十九页，总共五十八页。 二、PCR引物设计 PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。 其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。 现在三十页，总共五十八页。 1、引物长度一般为15~30个核苷酸。 2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3′端不应有连续3个G和C。否则会使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量在45~55%左右。设计引物时要考虑3′端和5′端 引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54°C 3、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。 4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3′端的互补重叠。 （一）PCR引物设计原则 现在三十一页，总共五十八页。 5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 6、引物3′端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3′端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。 现在三十二页，总共五十八页。 7、引物的5′端可以修饰，如附加