丙型肝炎病毒感染的抗体应答与免疫测定.pptVIP

用于抗HCV ELISA测定的抗原 有两类，一类为基因工程重组抗原，其优点是覆盖抗原位点多，抗原抗体反应强，如C33C。 另一类是合成肽抗原，其优点是易于纯化，试剂特异性较好，缺点是合成肽抗原由于分子量较小，缺乏空间构型决定簇，难免会造成漏检。 第十八页，共三十七页。 第一代抗HCV检测试剂 第一代抗HCV检测试剂是在1989年美国Chiron公司Choo等首先克隆的HCV基因组5-1-1片段的基础上建立的。他们将包括5-1-1在内的一个克隆（C-100）与编码人超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）的基因片段融合，在酵母细胞中表达了可用于检测抗HCV抗体的C100-3抗原，为C100与SOD的融合蛋白。 1990年美国Ortho和Abbott公司用C100-3抗原生产了第一代抗HCV ELISA试剂盒，并广泛应用于献血员的筛检及临床HCV感染的检测。 第十九页，共三十七页。 第一代抗HCV ELISA诊断试剂的缺陷 （1）特异性不高。常发现有假阳性，部份是由于患者血清中存在针对融合蛋白中的SOD的抗体；类风湿因子（Rheumatic factor,RF）阳性血清标本，也有很大一部份为抗C100-3抗体阳性。 （2）灵敏度低。抗体检出时间晚，大多数病人在HCV感染4～6个月后才能产生抗C100-3抗体，有少数要到1年以上甚至始终不出现抗C100-3抗体。C100-3灵敏度低可能与HCV存在不同亚型以及C100-3只占HCV基因组编码蛋白的一小部份等因素有关。 第二十页，共三十七页。 第一代抗HCV的RIBA确认试剂 1990年Chiron/Ortho公司联合研制了第一代RIBA试剂作为抗HCV的确认试剂，其使用两种HCV抗原即C100-3和5-1-1分别固定在硝酸纤维素膜上。这两种抗原都是与SOD的融合蛋白。检测时，C100-3和5-1-1带均为阳性则判为阳性，其中之一为阳性则判为不确定，两者均阴性者判为阴性。 第二十一页，共三十七页。 第二代抗HCV ELISA检测试剂 随着对HCV研究的不断深入，HCV的特异性核心区抗原P22（C22）和NS3区抗原C33C表达成功， 经与C100-3抗原对比检测发现，C22和C33C抗原的早期诊断能力均优于C100-3抗原，并提高了检测的灵敏度和特异性。 于是以包被核心和NS3区抗原为主的第二代抗HCV ELISA试剂盒应运而生，不同的厂家抗原的包被模式各有不同，主要有以下二种：（1）C22＋C33C；（2）C22和C200（C100＋C33C）。 第二十二页，共三十七页。 第二代抗HCV RIBA试剂 第二代RIBA试剂（RIBA－2）含有4种抗原成份，即C100-3、5-1-1、C33C（NS3区）和C22－3（C区）。 第二代RIBA试剂增加了核心区和NS3区抗原，检测的敏感性和特异性较第一代RIBA有所提高。 第二十三页，共三十七页。 第三代抗HCV ELISA试剂 其改进主要有：（1）根据各种HCV抗原在检测中所起的作用及其诊断价值调整了各组份在试剂盒中的比例，优化了试剂盒的组装工艺。由于C33C无论是在抗HCV早期诊断及提高检测灵敏度上都有重要价值，而C22中的HCV核心N－端保守区域易产生非特异性交叉反应，因此，在第三代试剂中，核心抗原比例相对下降，而相应增加了C33C的比例； （2）随着基因重组技术发展，对一些重要抗原采用更好的表达系统表达，对所采用的基因片段进行重新定位；利用各种先进的生产工艺，使原料抗原活性更强，增加了检测灵敏度，同时减小了非特异性； （3）发现了NS5区的血清学意义，增加NS5区抗原作为包被抗原。 第二十四页，共三十七页。 第三代抗HCV RIBA试剂（RIBA－3） RIBA－3所用抗原由核心区的C22、NS3区的C33C、NS4区的5-1-1和C100及NS5抗原组成，较之第二代试剂增加了NS5。 RIBA阳性，可充分说明病人的感染性及肝病的存在。 RIBA不确定结果有多种解释：（1）所有对RIBA－2中的5-1-1、C100－3或RIBA-3中的NS5的单独反应都代表假阳性；（2）RIBA－2中核心及NS3的不确定结果可能代表真阳性，其结果可被灵敏度更高的确认实验或E2的gp70抗原检测所证实；（3）在免疫自限性的高危人群中，不确定的RIBA结果有较大差异，但其中绝大部份都有病毒血症及肝炎存在。 第二十五页，共三十七页。 三代抗HCV ELISA测定试剂的比较 试 剂 包被抗原 窗口期 敏感性 特异性 第一代 C100－3 3～4个月 80％～90％