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RFLP是如何发现的? 在犹他州盐湖城滑雪胜地艾尔塔的一场例行的学术讨论中, 从事经典人类遗传学研究的专家与从事分子生物学研究的专家进行学术交流. 分子生物学家从经典遗传学的研究中获得灵感. RFLP的产生 AFLP是一种测定基因组限制性片段的DNA指纹，1995年Vos等首次报导。 AFLP技术的基本原理是利用PCR技术，选择性扩增基因组DNA双酶切的限制性片断，基因组DNA经限制性内切酶消化后，将一双连DNA街头连接与限制性酶切片段的两端，然后根据接头序列和限制位点邻近区域的碱基序列，涉计一系列3末端含数个随机变化的选择性碱基的PCR引物进行特异性条件扩增，只有那些限制位点的侧翼序列与引物3’末端选择性碱基先匹配的片段才能得到扩增.扩增产物经变性聚丙烯酞氨凝胶电泳分离，显示其多态性 （3）扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP） AFLP的操作程序 AFLP的优点 (1)可用于大小不同的基因组的指纹分析，为研究物种间的亲缘关系尤其是原核生物属以下乃至菌株间提供了一个有效的手段; (2)具有一定的灵活性，可通过特异性PCR引物的设计和内切酶组合的选择，去调整AFLP图谱中限制性片段的适宜数目； (3)由于使用了严格的PCR条件和高分辨率的聚丙烯酞胺凝胶电泳，因而重复性好，分辨率高; (4) AFLP不仅是个简单的指纹技术，而且可作为连 接遗传图谱与物理图谱间的桥梁而用于基因组的研究。 其原理与RFLP法相似，只是PCR中所用引物一端或两端带有标记，因此酶切所得的末端片段被标记，电泳后通常只分析此末端片段的种类、长度与数量。优点：由于酶切片段中仅有末端片段长度被测定，每一种长度的末端片段至少代表一种微生物基因型，因此可以直接给出对群落中微生物种群数的最小估计值。缺点：由于仅有末端片段长度被分析，获得的信息较少，不足以分析非常复杂的微生物群落，如土壤微生物群落，因为多种微生物的酶切末端片段长度可能相同，造成对物种丰度的估计过低。 （4）末端限制片段长度多态性(Ｔ－ＲＦＬＰ) 末端限制性片段技术基本过程 基本原理: 在不知道或不考虑模板基因序列的情况下,利用随意设计的非特异引物。在不严格的ＰＣＲ条件下(低退火温度)使随机引物与模板ＤＮＡ序列互补结合后,经Ｔａｑ聚合酶的作用使引物延伸,在两个扩增引物之间释放的ＤＮＡ片段再经ＰＣＲ扩增,很快达到相当的数量,并能在琼脂糖电泳中出现明显的谱带。数个循环后,终产物电泳后得到ＤＮＡ指纹图谱,通过图谱间的比较即可将差异区分开。 （5）随机扩增DNA多态性分析(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 优点: （1）不需要了解要扩增基因的碱序列,尤其适于那些序列还不清楚的基因; （2）引物的碱基少,合成迅速; （3）操作简便,结果直观; （4）区分能力强,可借助不同长度的引物扩增,以加强其区分能力； （5）而且能够扩增整个基因组ＤＮＡ,所以它比ＲＦＬＰ分析更好地代表基因组特性。 缺点 （1）重复性差：不各种因素易引起结果的不确定性,如模板ＤＮＡ的质与量、ＭｇＣｌ2的浓度、引物等方面的差异可以造成不同模式； （2）结果的可比性不强：从这些谱带中,很难获得系统发育信息; 改进: 1)制定统一引物筛选原则； 2)严格控制实验条件,提高结果的可比性; 3)根据鉴别能力和鉴别要求(如不同属间,种间,株间,型间的差异)的不同,选取不同的引物; 4)ＲＡＰＤ产物的凝胶电泳图谱转化成合适的数据,进行数学统计分析。 1979年提出的用于检测ＤＮＡ突变的一种电泳技术。它的分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高,可以检测到一个核苷酸水平的差异。 1993年首次将ＤＧＧＥ技术应用于分子微生物学研究领域,并证实了这种技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特的优越性。 （6）变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE) 基本原理 通过不同序列的ＤＮＡ片段在各自相应的变性剂浓度下变性发生空间构型的变化,导致电泳速度的急剧下降,最后在其相应的变性剂梯度位置停滞,经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。 该技术可以分辨具有相同或相近分子量的目的片段序列差异,可以用于检测单一碱基的变化和遗传多样性以及ＰＣＲ扩增ＤＮＡ片段的多态性。 基本原理与ＤＧＧＥ技术相似,含