06第五章动物卵母细胞与胚胎冷冻保存技术.pptxVIP

第五章 动物卵母细胞与胚胎的冷冻保存技术河南农业大学 韩雪蕾目 录 第一节 卵母细胞与胚胎冷冻保存的意义第二节 卵母细胞与胚胎的冷冻保存原理第三节 卵母细胞与胚胎的冷冻保存方法 卵母细胞与胚胎的冷冻保存：是采取特殊的保护措施和降温程序，使卵母细胞或胚胎在-196℃条件下停止代谢，使细胞处于新陈代谢和分裂速度停止，即使其发育基本处于暂时停顿状态，而升温后又不失去代谢恢复能力的一种长期保存胚胎和卵母细胞的技术。第一节 卵母细胞与胚胎冷冻保存的意义一、卵母细胞冷冻保存的意义(1)哺乳动物卵母细胞的有效冷冻保存是保护品种资源和拯救濒危动物不可缺少的技术保障之一。 (2)是加快家畜品种改良和胚胎移植技术产业化的重要组成部分，可代替活畜进口，不受时间和空间的限制。 (3)可用于卵母细胞的低温生物学特性和体外受精机理研究。(4)通过冷冻保存卵母细胞，不但可以建立雌性动物的基因库，还可以充分利用丰富廉价的卵母细胞资源，使体外受精、转基因及克隆等技术的研究应用不受时间和地域的约束。 (5)在医学方面，人卵母细胞的冷冻保存可以克服胚胎冷冻保存所引起的伦理道德以及法律上的问题，为那些接受化疗、放疗或由于其它病理原因而过早摘除卵巢或输卵管堵塞病人提供怀孕的机会。迄今为止，卵母细胞的冷冻保存以小鼠、牛为主要研究对象，其冷冻方法趋于成熟，冷冻后的卵母细胞形态正常率、受精率、发育率及移植后的产仔率等方面均取得了一定进展。牛卵母细胞冷冻的研究主要集中在玻璃化方法的应用和寻求减少冷冻液体积和加快降温速率的方法上，在低温生物学机理和探讨冷冻损伤的机理方面做的还不够，因此，卵母细胞的冷冻保存条件及低温生物学特性等方面还有待进一步研究。二、胚胎冷冻保存的意义（一）胚胎冷冻保存的意义为建立优良的动物胚胎库和基因库提供了条件；可使因疾病、天灾或战争等其他原因丢失的各种动物品种、品系和稀有突变体得以保持；可以控制品种内的遗传稳定性和维持某些近郊系动物的遗传一致性，节约大量时间和资金；家畜胚胎库的建立可实现简便廉价的远距离运输胚胎，以代替运输活畜，节约运输和检疫成本；减少因活畜运输而传播疾病的机会，促进了国际良种的交换。（二）胚胎冷冻保存的发展概况胚胎的冷冻保存开始于1972年， 由Whittingham首次在小鼠上取得成功。此后，国外在牛（Wilmut等，1973）、绵羊（Willadsen等，1974）、山羊（Bilton等，1976）和马（Ramamato等，1982）等动物的冷冻胚胎移植方面相继取得成功。在国内，绵羊、兔、牛、山羊等动物冻胚移植也均获得成功。目前，欧、美、日、加等国有上百家胚胎移植公司从事牛、羊胚胎移植业务。在国内，牛的冷冻胚胎生产与移植已开始逐步商业化。 第二节 胚胎与卵母细胞的冷冻保存原理胚胎与精子细胞结构差异：胚胎数量极少胚胎体积比精子大很多(精子为9um,卵子直径为120um)，细胞质多，外包特殊膜—透明带。胚胎为发育中的细胞，细胞内水分占80%，结构结构和新陈代谢过程更为复杂（精子为单细胞，胚胎为多细胞，受精卵随第二极体的排出，新陈代谢逐步加强）。胚胎孕育着新的生命（娇嫩）。一、卵母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的 受损机制1、细胞内冰晶损伤胚胎与精子相比，含水量较高，而在冷冻过程中，有90 ％的水分形成游离水，而游离水易形成冰晶，从而破坏蛋白质的硫氢键，发生不可逆变化，导致细胞死亡。在胚胎及卵母细胞冷冻过程中，当温度降低到冰点以下，在细胞外液内液都有冰晶产生，使细胞受到致命性的损伤（物理损伤），这个因素也是胚胎及卵母细胞冷冻保存的关键。快速冷冻时，由于降温速率快，结晶时的冰晶核较多，从而形成数目多且体积小的冰晶，对细胞造成的损害较小。如果解冻时采取快速复温，则细胞仍能存活，但若在解冻过程中，在温度较高的区域（如-40℃或更高）经历较长时间或进行慢速复温，则会产生重结晶现象，即细胞内小冰晶重结晶成大冰晶，从而机械性的破坏细胞的超微结构而造成细胞的致命损伤。2、细胞外冰晶损伤慢速冷冻时，冰晶首先在细胞外形成，细胞外液冰晶形成后，使得溶液中离子浓度的升高，对细胞产生了离子影响，此损伤又称盐损伤。随着更多冰晶的产生，使溶液逐渐浓缩，溶液的浓缩对细胞的影响越来越大，此现象被称为溶液效应又称为化学损伤。冷却的速度越慢，则浓度越高，对卵母细胞的作用时间也越长，对卵母细胞膜蛋白复合体造成的伤害也越大。这主要是由于细胞内外的电解质浓度增高，导致细胞膜蛋白复合体的破坏和核膜的降解。3、破裂损伤采用快速冷冻法的卵母细胞或胚胎解冻后可见到透明带破裂，这主要是由于物质的膨胀率和收缩率不同，这种现象被称作破裂损伤。由此可见，破裂损伤往往发生在液相和固相急速转化的过程中。因此，慢速冷冻时缓慢通过冷冻液变相温度区域非常重要。慢速解冻法通常是