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原核表格达操作步骤及注意事项 原核表格达操作步骤及注意事项 原核表格达操作步骤及注意事项 原核表达操作步骤及注意事项 时间：2010-03-0314:05:01本源：作者：点击：1046次 将克隆化基因插入适合载体后导入大肠杆菌用于表达大批蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能解析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特色： 易于生长和控制；用于细菌培育的资料不及哺乳动物细胞系统的资料昂贵；有各样各样的大肠杆菌菌株及与之般配的具各样特点的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白因为缺乏修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中拥有十分重要的作用，原核表达载体平时为质粒，典型的表达载体应拥有以下几种元件： 1）选择标记的编码序列； 2）可控转录的启动子； 3）转录调控序列(转录停止子，核糖体结合位点)； 4）一个多限制酶切位点接头； 5）宿主体内自主复制的序列。原核表达一般程序以下： 获取目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序考据）－转变表达宿主菌－引诱靶蛋白的表达－表达蛋白的解析－扩增、纯化、进一步检测 一、试剂准备 1、LB培育基。 2、100mMIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38gIPTG溶于100mlddH2O中，μm滤膜抽滤，-20℃保留。 二、操作步骤 （一）获取目的基因 1、经过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获取所需基因片段。 2、经过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总  RNA，以  mRNA为模板，逆转录形成  cDNA第一 链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获取产物。 （二）成立重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。 （三）获取含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转变大肠杆菌DH5α，依据重组载体的标记（抗Amp或蓝白斑）作精选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步判断。 2、测序考据目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。不然应精选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转变表达宿主菌的感觉态细胞。 （四）引诱表达 1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2mlLB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培育。 2、按1∶50比率稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培育基的300ml培育瓶中，37℃震荡培育至OD600≌（最好，大概需3hr）。 3、取部分液体作为未引诱的比较组，余下的加入IPTG引诱剂至终浓度0.4mM作为实验组，两组连续37℃震荡培育3hr。 4、分别取菌体1ml，离心12000g×30s收获积淀，用100μl1%SDS重悬，混匀，70℃10min。 5、离心12000g×1min，取上清作为样品，可做SDS平解析。 三、注意事项 1、选择表达载体时，要依据所表达蛋白的最后应用考虑。如为方便纯化，可选择交融表达；如为获取天然蛋白，可选择非交融表达。 2、交融表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能够发生搅乱。 怎样做原核表达（prokaryoticexpression） 2010-03-2622:54:25本源：易生物实验阅读次数：673网友议论0条 第一来一些大肠杆菌表达的基本观点：一个完好的表达系统平时包含配套的表达载体和表达菌株，若是是 特其他引诱表达还包含引诱剂，若是是交融表达还包含纯化系统也许Tag检测等等。选择表达系统平时要 依据实验目的来考虑，比方表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归纳在表达载 体的选择上。 重点词：原核原核表达prokaryoticexpression 人们合成与生物有关的物质是从尿素开始的，1828年，德国化学家维勒人工合成了存在于 生物体的这种有机物。在1960年我国科学家采纳化学方法首次成功地合成了拥有生物活性 的蛋白质——胰岛素。随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各样不同的载 体在原核、真核系统中进行蛋白表达更加卓有收效。而这此中大肠杆菌表达系统发展得最为 迅速、成熟。原核表达拥有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工业化生产等长处。 固然也出缺乏糖基化和表达后加工等问题，当有了其余多种表达系统后，原核系统仍是我们 合成外源蛋白的首选。 在网上看到有人把原核表达技术分成四个等级：首次试一试扫盲、乱棍打枣入门、系统优化中