DNA重组克隆的单元操作课程.pptVIP

2) 修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C … 5’ P nick OH T4-DNA连接酶 5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C … 5’ 第五十三页，共一百一十一页。 3)连接多个平头双链DNA分子： 5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’ T4-DNA连接酶 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’ 第五十四页，共一百一十一页。 Tris-HCl 50-100 mM pH 7.5 MgCl2 10 mM ATP 0.5-1 mM DTT 5 mM Volume 10 - 20 ml T T 4 - 15 ℃ 4 - 16 hr 4、DNA连接酶的反应条件 1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃反应 1 小时，完全连接 1 mgλ-DNA（Hind III片段）所需的酶量。 第五十五页，共一百一十一页。 （1）必须是两条双链DNA。 不能催化两单链DNA分子连接； 只能连双链DNA分子的单链缺刻(nick)；不能 连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致缺(gap)。 连接条件 第五十六页，共一百一十一页。 DNA ligase 的活性 第五十七页，共一百一十一页。 （2）DNA3’端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P）。 （3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+ 连接条件 第五十八页，共一百一十一页。 连接酶反应的最佳温度是37?C。 连接反应的温度 最佳温度 在37℃下粘性末端的结合很不稳定。 实用温度 所以一般采用 4~16 ?C。 第五十九页，共一百一十一页。 4、平头双链DNA片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。 提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM 第六十页，共一百一十一页。 （一）基因工程中常用的DNA聚合酶： 大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T4 噬菌体DNA聚合酶 4. T7 噬菌体DNA聚合酶 5. 耐热DNA聚合酶 6. 反转录酶 7.末端转移酶 四、DNA聚合酶 第六十一页，共一百一十一页。 1. 共同特点 把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。 2. 主要区别 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。 其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。 （二）常用的DNA聚合酶的特点 持续合成能力和外切酶活性不同。 第六十二页，共一百一十一页。 （三）DNA聚合酶在基因工程中的用途 1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I （1）大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质 ①一条单链多肽。 ⑤ 5’?3’外切酶活性位于N端。 用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5’?3’外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。 ②5’?3’ DNA聚合酶活性。 ③5’?3’外切酶活性 ④ 3’?5’外切酶活性 第六十三页，共一百一十一页。 ① 底物： dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） ② Mg2+ ③ 带有3’-OH游离端的引物 ④ DNA模板 （2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件 -OH 5’ 3’ dNTPs 第六十四页，共一百一十一页。 标记 ① 核酸探针（probe） 能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。 （3）用DNA聚合酶I 制备探针 已知序列的核酸片断 显示位置 与互补的待测序列杂交 第六十五页，共一百一十一页。 标记 已知序列的核酸片断 ② 探针的标记方式 标记 已知序列的核酸片断 带有放射性的已知序列的核酸片断 5’ 3’ 第六十六页，共一百一十一页。 ③ DNA聚合酶I 对探针序列的标记 切口转移法(nick translation )： 放射性同位素标记：