《细胞与显微技术学》活细胞观察与相差显微镜的使用.ppt

一. 实验目的 1.了解相差显微镜和暗视野显微镜的基本原理和结构特点。 2. 比较活细胞与固定后细胞的形态差异。 实验二 1.活细胞观察及相差显微镜的使用 2.细胞形态观察与暗视野显微镜的使用 普通显微镜 相差显微镜 二. 实验原理 ??? 细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置--环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。 直射光波长推迟1/4λ 样品衍射光波长推迟1/4λ 光源 环状光阑 相位板 -1/4λ 明相差显微镜（负相差） 物体是明亮的而背景是暗的 样品衍射光波长推迟1/4λ 光源 环状光阑 相位板 -1/2λ 暗相差显微镜（正相差） 物体是暗的而背景是明亮的 样品衍射光波长又推迟1/4λ /tutorials/java/phasecontrast/opticaltrain/index.html /tutorials/java/phasecontrast/positivenegative/index.html 三、实验程序 (一)相差显微镜的使用 1. 相差显微镜的装置 取下普通显微镜的聚光器，换上带有环状光阑的转盘聚光器，并将标示孔指0(即明视野);取下普通物镜，装上相差物镜。 2. 调焦和调光 用普通低倍物镜在明视野中观察，当发现目标后，把观察的目的物移到视野的中央。观察透明物体时要缩小光栏，当用相差物镜在明视野对好焦点后，换上相应的相差物镜，例如10X,20x相差物镜分别用ph1、ph2标示孔的光栏，并充分开大孔径光栏。 聚光镜转盘中的安装托盘 Ph1 Ph2 Ph3 DIC DIC D 明视野 孔径光阑 3. 中心调节（合轴调节） 拨出目镜，插入中心望远镜，用左手固定其外筒，一边眼看望远镜，一边用右手转动望远镜内筒使其升降，对准焦点后就能看到环状光栏的亮环和相板的黑环。此时可将望远镜固定，微微转动聚光器两侧的调节钮，使两者完全重合。如果亮环和黑环大小一不致，可升降聚光器便之一致，如果升降聚光器仍不能矫正亮环和黑环一致的话，那就是载、盖玻片过厚的缘故。换用不同物镜要同时更换相对应的环状光栏，并重新合轴。 2.细胞形态观察与暗视野显微镜的使用 实验原理： 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 几种显微镜的观察效果对比 普通显微镜 暗视野显微镜 微分干涉差显微镜 相差显微镜 (二)动物活细胞的相差显微镜和暗视野显微镜的观察 观察蛙肝细胞装片 1.用镊子和解剖针，把蛙的肝组织小块放在载玻片上，滴上生理盐水，分离出游离肝细胞。在相差显微镜下，可见折射率较高的大的球形细胞核，内含折射率更高的小颗粒 核仁。在细胞核周围还可见到许多暗白的小颗粒即为线粒体。细胞质中还有许多大小不等明亮的细胞质颗粒。 2.取一小块肝组织，放入1.5ml离心管中，加入生理盐水剧烈震动洗去血液，去除上清液，用生理盐水再洗1遍， 1400rpm离心5min去上清，加入200微升胰蛋白酶，37℃温20min，其间用1ml枪头吹打2-3次。 3.加入500微升生理盐水后1400rpm离心5min，去上清，用200微升生理盐水悬浮沉淀，取50微升滴加在载玻片上，盖上盖玻片后观察。 四. 作业 描绘出蛙肝细胞在相差显微镜和暗视野显微镜下的基本形态结构。 * 暗相差　　?在被检物的折射率大于介质的情况下，透过共轭面的直射光被吸收80%后亮度变暗，衍射光在通过被检物后其相位己推迟1/4波长，再在位相板的补偿面的电解质又推迟了1/4波长。由于这两束光的相位不同(差1/2波长)，其合成波的振幅为两者之差，所以光线就更加暗。　　?与此同时，通过无结构介质的衍射光的光程只被补偿面的电介质推迟l/4波长。这就造成通过光密物质的光强远比通过无结构介质(背景)的光强减衰得多。相差显微镜下标本细节的反差加大丁。光密结构比背景暗得多了。这种反差叫暗反差也叫正反差。　　明相差　　?如果相板的共轭面上涂的是减速