《细胞与显微技术学》免疫荧光技术观察肿瘤细胞骨架.ppt

免疫荧光技术观察肿瘤细胞骨架 根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 实验原理： 异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate, FITC） 　　呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存2年以上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为520～530nm，呈现黄绿色荧光，分子量为389.4。 　　在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个Ig分子上最多能标记15～20个FITC分子。 人宫颈癌上皮细胞 爬片（HeLa） 多聚甲醛固定液配法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀 透化试剂： 950ml 0.1M PBS中加入20×TritonX-100母液 50ml（终浓度为0.5%） 20×TritonX-100母液（10％）：180ml PBS中加入 20ml TritonX-100 至完全溶解 20×Tween-20母液（2％）：10ml PBS中加入0.2ml Tween20 肿瘤细胞及实验试剂： 一抗：小鼠抗人β-actin多克隆抗体，用时稀释了200倍。 二抗：羊抗鼠免疫球蛋白（FITC标记），用时稀释60倍 一抗稀释液：1ml PBS中加入0.02g牛血清白蛋白（BSA）粉末，溶解后加入20×Tween-20母液25～50μl（终浓度0.05%～0.1％）。 二抗稀释液：配法同一抗。 抗体准备 1．去除35mm Dish 中的培养基，用1ml PBS中洗一次，去除PBS； 2．多聚甲醛固定液中室温固定20min； 3. 将爬片放入35mm Dish（铺好滤纸）中，在其上滴加50ul含0.5% TritonX-100的PBS，室温透化20min； 4．吸去透化液，加200ul PBS清洗3次，每次3min； 5．用镊子小心将盖玻片夹起，用滤纸吸干水分，放入事先铺好滤纸，并用PBS浸湿的一新35mm Dish中间，滴加80ul 2％BSA封闭液，室温温育20min； 6．用滤纸上吸至半干； 7．滴加30 ul一抗稀释液至细胞表面， 37℃恒温箱中温育60min；9．PBS洗三次，每次10min（摇床中进行）；10. 滴加50ul荧光标记的二抗室温温育60min（避光）；11．PBS洗三次，每次3min（摇床中进行）； 12. DAPI 50ul染色5 min ，PBS漂洗1min； 13．滤纸上吸干玻片上残余的液体，在干净载玻片上滴一滴封固剂（~10ul），细胞面朝下盖于封固剂上，在载玻片上贴好，赶走气泡；14．避光保存待观察。 实验步骤： 预备实验结果 HeLa cell Actin-FITC 染色 DAPI 染色 DAPI-FITC 染色 作业:试述免疫荧光技术的基本原理, 并描述实验中所观察的实验现象。