《细胞与显微技术学》Feulgen及PAS反应.ppt

实验目的与要求 掌握Feulgen反应的基本原理及操作步骤; 观察细胞中DNA的分布； 掌握PAS反应的基本原理及操作步骤; 观察细胞中多糖的分布。 取一块边缘光滑的载片做推片。将其一端置于血滴前方，向后移动到接触血滴，使血液均匀分散在推片与载片的接触处。然后使推片与载片呈30°～40°角，向另一端平稳地推出，如右图所示。涂片推好后，迅速在空气中摇，使之自然干燥。 * DAPI 标示细胞核的基本原理 细胞核内的染色质主要是 脱氧核糖核酸（DNA） DNA的双螺旋结构 DAPI与溴化乙锭（EB）类似：与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，可用UV（紫外光）的激发波长356nm进行观察。 DAPI染色标示细胞核呈蓝色荧光 DAPI 标示细胞核的基本原理 ?原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的分布和含量。 细胞化学实验 目的：显示细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等。 核酸的显示方法——Feulgen反应 糖类的显示方法——PAS反应 细胞化学实验 是显示DNA的最典型的组织化学反应，为学者Feulgen于1924年发明，简称为Feulgen法。因对DNA的显示反应具有高度专一性，故常被用来显示细胞内DNA的分布情况。 Feulgen反应 (Feulgen reaction) DNA经酸（1mol/L HCl）水解后，分子中的嘌呤和脱氧核糖连接的配糖键被打开，脱氧核糖的一端释放出游离的醛基，并在原位与Schiff试剂反应形成特异性的紫红色产物。因此在有DNA的部位，就会呈现出紫红色的阳性反应。 Feulgen 反应的基本原理 DNA在酸性条件下水解 将0.5g碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中，时时摇动玻璃瓶，煮沸5 min使之充分溶解，冷却至50℃时过滤，加入10 ml 1M HCl，冷至25℃时，加入0.5g偏重亚硫酸钠(Na2S2O3)或无水亚硫酸(NaHSO3)，在室温冷暗处至少放置24h(有时需2-3天)，使其颜色退至淡黄色，密封瓶口，藏于暗处，最好保存于4℃冰箱中(可保存数月或更长时间)。在使用前加入0.5g活性碳, 摇1 min, 用粗滤纸过滤，滤液应为无色；若液体颜色变为粉红色，便不能再用。 Schiff氏试剂的制备 Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠/钾作用，形成无色的品红液。无色品红与醛基结合则形成紫红色的化合物，这是因为反应产物的分子内含有发色基团醌基所引起的。 Schiff氏试剂的使用 染色时使用镊子夹取载玻片； 染色缸盖好盖子 Schiff 试剂中的红色品红转变成无色品红 醛基与 无色品红结合，形成新的有色化合物 染色缸侧面示意图 载玻片 注意：载玻片插入染色缸中应插在凹槽中，尽量避免两片载玻片贴在一起，否则会摩擦掉上面的细胞。 染色缸的使用: 实验材料一：青蛙血涂片 实验材料二：洋葱鳞茎内表皮细胞 滴 撕 展 35 mm 培养皿 染 实验流程 涂片 （2片/人） 样品 对照 干燥 盐酸水解 8~10m 60℃ Schiff试剂 室温 60m 对照片空气 干燥 甲醇室温固定 5 min， 晾干 镜检 蒸馏水 漂洗 盐酸水解 1m 室温 蒸馏水 漂洗 亚硫酸盐 溶液，洗 三次共6 m 蒸馏水 漂洗 亮绿复染 2s 样本片 对照片 预期的实验结果? 实验组经Feulgen反应显示核结构细致、清晰，细胞核染成粉红色至紫红色，核仁不着色。经亮绿处理的细胞的细胞质部分显绿色。 对照组由于DNA没有释放出醛基，细胞核显示出被亮绿染上的绿色，无红色出现。 如果亮绿处理时间过长，则会造成细胞核区颜色过深。 Feulgen反应 制备鸭血涂片，甲醇室温固定5 min，凉干; 蒸馏水过一下； 1 mol/L 盐酸(600C )水解8-10 min; 1 mol/L 盐酸（室温）1 min; 蒸馏水稍洗； 置Schiff试剂中室温染色1小时左右； 亚硫酸盐溶液洗3次，总时间为6 min（或滴加在洋葱表皮上） 自来水流水冲洗5 min，蒸馏水过一下； 用1%亮绿水溶液复染5-10秒； 自来水流水冲洗2 min（洋葱表皮注意不要被水冲洗掉） 蒸馏水稍洗； 甘油/PBS封片剂封片； 显微镜观察。 PAS（Periodic Acid Schiff ）反应的基本原理 糖原染色