《细胞与显微技术学》叶绿体的分离与观察和细胞大小的测量.ppt

* 实验三 1.叶绿体的分离与观察和细胞大小的测量 一. 实验原理 1.细胞和细胞成分的分离。组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，可以分离不同大小的细胞器。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 2.应用显微镜的成像原理，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，得出细胞的大小 叶绿体是绿色植物细胞中重要的细胞器，是光合作用的场所。在光合作用研究中，常需提取叶绿体开展研究工作。研磨叶片得到的匀浆，经过滤、离心可制备叶绿体。 高等植物叶绿体象双凸或平凸透镜,长径5-10um，短径2-4um，厚2-3um。高等植物叶肉细胞一般含50～200个叶绿体,可占细胞质的40%,叶绿体的数目因物种细胞类型,生态环境,生理状态而有所不同。  ? ? 核糖体 105000g x 20min +0.26%脱氧胆酸钠 F 微粒体 105000g x120min E 线粒体、溶酶体、微体 10000g x20min D 叶绿体 3000g x 6min C 细胞核，细胞碎片 1000g x 20min B 完整细胞 150g x 20min A 内 容 物 转速x时间 沉淀 差速离心形成的沉淀（植物） 二.试剂与器械 1. 器材 : 普通离心机，组织捣碎机，粗天平，烧杯2个, 250ml量筒1个, 滴管20支, 10ml刻度离心管20支, 试管架5个，纱布若干，无荧光载玻片和盖玻片各4片，光学显微镜,镜台测微尺。 2. 试剂: 等渗溶液（0.01mol/L NaCl+0.05mol/L Tris缓冲液 PH=7.6, 0.4mol/L 蔗糖），瑞氏染液 3.材料：菠菜，鸭血 三. 实验步骤 （一）叶绿体的分离与观察 1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称20g于50ml 等渗溶液中，装入组织捣碎机。 2.利用组织捣碎机（转速设置为2档）匀浆30秒。 3.将匀浆用2层纱布过滤于100ml烧杯中 (滤掉大组织碎块）。 4.将滤液分装于10ml离心管中(每管6ml/每人),在1000r/min 下离心2min （除掉细胞及细胞核）。 5. 将上清液倒入新10ml离心管中在3000r/min下离心5min。 小心弃去上清液，沉淀即是叶绿体(混有部分细胞核)。 6. 将沉淀用2ml等渗溶液悬浮。 7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微 镜下观察。 分离叶绿体 菠菜叶20克加50ml等渗溶液匀浆　　　↓　　匀浆过滤　　　↓ 将滤液6mL用1000rpm离心2min 　　 ↓ 转移上清液至干净离心管中,弃沉淀(细胞核及碎片） 　　 ↓  用3000rpm离心5min 　　 ↓ 沉淀（叶绿体及少量细胞核） ↓ 用2ml等渗溶液悬浮沉淀 ↓ 取叶绿体悬液滴于载玻片上镜检 　 十字板 分划板 网格板 (二） 利用测微尺测量细胞大小 1. 常用显微镜目镜测微尺种类 镜台测微尺 目镜测微尺 2. 测微尺的使用操作 1毫米分成100个小格 每一小格长度=10微米 1.取下目镜,将目镜测微尺的刻度面向下放入目镜中,旋上透镜（后面四排显微镜目镜中已安装了测微尺,不必自己安装）；  2.将镜台测微尺盖片面朝上放在载物台上,用低倍镜观察,调节焦距看清镜台测微尺的刻度； 3.移动镜台测微尺,同时转动目镜,使目镜测微尺与镜台测微尺平行靠近,并将两尺的“0”点刻度线或某刻度线对齐.然后从左向右查看两尺刻度线另一重合处,记录重合线间目镜测微尺与镜台测微尺的格数。 目镜测微尺的100格与镜台测微尺的50格重合 目镜测微尺 镜台测微尺 在某一物镜倍数下 a. 将绿豆大小血滴滴于清洁玻片上。 b. 另取边缘平滑的玻片作为推片：推片一端放在血滴的前方，逐渐后移，接触血滴并使血滴沿推片边缘均匀展开，然后将推片与玻片保持 30 － 45 度角，轻轻用力，均匀而迅速地将推片沿玻片表面向前推至玻片另一端，形成头体尾明显的舌形血膜。立即将玻片摇动，使其快速干燥，忌热力干燥。 注意：血膜厚度与血滴大小、推片角度和速度有关， 血滴大，角度大，速度快则血膜厚，反之则薄。 推片与玻片度角 推完血玻片 向后接触血滴 血滴均匀展开 (三) 鸭血细胞的观察与测量 1.制作鸭血涂片： (三) 鸭血细胞的观察与测量 1.制作血涂片: