《细胞与显微技术学》细胞传代与冻存.ppt

实验九、细胞传代与冻存 实验目的：掌握细胞冻存的方法，能独立地进行细胞冻存的操作。 实验原理： 当细胞在培养皿中长满后就需要将其稀释分种成多个培养皿,细胞才能继续生长.这一过程就叫传代.传代培养可获得大量细胞供实验所需. 利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验 。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5％-15％的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用慢冻快融的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃／min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。 实验步骤：细胞传代 1. 先准备好新培养皿，加入4.3mlDMEM，0.5ml FBS. 2.用5ml移液管吸掉培养皿（1个）中的旧培养基，用3ml PBS洗去残留的旧培养基后，吸掉PBS，加入0.5ml胰酶，充分覆盖细胞后，吸掉胰酶，室温静置3-5分钟，待细胞变圆漂浮起来后（可在倒置显微镜下观察）， 加入4mlDMEM吹洗细胞，制成悬浮细胞,移入5ml离心管中，1200rpm离心5分钟。去上清后，加入1mlDMEM充分混匀细胞，取200ul加入上述准备好的培养皿中，最后移入CO2培养箱中继续培养。（每组传一盘即可） 二. 暗视野显微镜 dark field microscope 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 可观察 4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。 几种显微镜的观察效果对比 * 细胞株：培养的HeLa细胞 器材: 冻存管、离心管、5ml枪头、60mm Dish,水浴锅等试剂：DMEM培养基、小牛血清、DMSO、胰蛋白酶 实验材料 实验步骤：细胞冻存 1. 冻存液的准备：取5ml离心管一个，按照7:2:1的比例分别加入DMEM、FBS、DMSO，终体积为2ml. 2. 用5ml枪头吸掉所有培养皿中（9个）的旧培养基，每个培养皿中加入3ml PBS洗去残留的旧培养基后，吸掉PBS，分别加入0.5ml胰酶，充分覆盖细胞后，吸掉胰酶，室温静置2-3分钟，待细胞变圆漂浮起来后（可在倒置显微镜下观察），在第一个培养皿中加入4mlDMEM悬浮细胞后,移入第二个培养皿中，悬浮细胞，然后再移入第三个培养皿中，依次类推，最后将悬浮液移入5ml离心管中，1200rpm离心5分钟。去上清后，加入1ml上述冻存液，充分悬浮细胞，然后将细胞悬液移入冻存管中。在冻存管表面标明日期、细胞名称、姓名。 3.将冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。(每组冻存一管) 思考题 简述细胞传代的过程 简述冻存细胞的过程 一、荧光显微镜的成像原理 荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。 实验十、 荧光显微镜与暗视野  显微镜的使用 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。 即：物质吸收短波光，发射出的长波光。 什么是荧光 ? 保持固有的荧光特性 荧光波长＞激发波长 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度 荧光的性质 自发荧光 二次荧光 荧光的种类 优点： 检出能力高 对细胞的刺激小 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察 荧光的有无、色调比较进行物质判别 发荧光量的测定对物质定性、定量分析 荧光显微镜的优点和用途 透射式荧光显微镜 落射式荧光显微镜 荧光显微镜的成像原理 荧光素的特性 丫啶橙 与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光 1.与DNA结合量少发绿色荧光 2.与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。 在荧光显微镜下观察,使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光； 该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。 荧光素直接标记技术 免疫荧光技术（直接免疫荧光技术和间接免疫荧光技术） 荧光原位杂交技术（荧光素直接标记探针） 荧光显微镜技术 免疫荧光技术 *