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谷氨酸棒杆菌中人胃内因子的表达及活性分析讨论 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：谷氨酸棒杆菌中人胃内因子的表达及活性分析讨论 1 1、材料与方法 2 2、结果 4 3、讨论 6 文2：乳腺癌前哨淋巴结中人乳球蛋白的表达及临床意义 7 1 资料与方法 8 1. 2 方法 8 2 结果 9 3 讨论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 12 正文 谷氨酸棒杆菌中人胃内因子的表达及活性分析讨论 文1：谷氨酸棒杆菌中人胃内因子的表达及活性分析讨论 人胃内因子(Gastric intriic factor，gif，GIF)是一种由胃黏膜壁细胞产生的糖蛋白(NCBIReference Sequence: NP_;GeneID:2694)，具有结合并保证维生素B12有效吸收的功能。有人通过该作用机制提出了一种口服给药方式，可以保证药物不被降解且被人体有效吸收[1]。在人体内，GIF的缺乏将直接导致机体无法正常吸收维生素B12，进而引起机体患恶性贫血[2]。Mottram等人通过小鼠模型研究发现GIF缺失会导致机体免疫力下降，易感染肠道沙门氏菌等病菌[3]。GIF由胃黏膜壁细胞产生，存在于人的胃肠道内，与食物中的VB12结合后通过小肠吸收，在维持机体健康中扮演着重要角色，但是目前尚未有关于表达生产人胃内因子的研究报道。 此前，C. glutamicum主要应用于各种氨基酸和醇等小分子的生产[4，5]。研究发现，其在蛋白表达上同样具有优势。它不产内毒素，胞外水解酶活性低，能够产生正确折叠的外源蛋白[6]。目前已有用C. glutamicum表达scFv、EGFP、VHH和淀粉酶等外源蛋白报道[7，8，9]。C. glutamicum可以作为一种优良的宿主用于各种蛋白的发酵生产[10，11]，尤其是一些对内毒素等严格限制的药用蛋白。本研究拟利用谷氨酸棒杆菌(C. glutamicum )进行药用蛋白人胃内因子的表达生产。 1、材料与方法 材料 E. coli 。pXMJ19保藏于本实验室;pUC57-kan由苏州金唯智有限责任公司提供。 PrimeSTAR? Max DNA Polymerase，DNA LigationKit购自TAKARA公司; Hind III、BamH I购自Thermo公司;DNA凝胶回收、PCR纯化和质粒小量提取试剂盒均购自Axygen公司;人胃内因子(GIF)ELISA检测试剂盒购自ImmunoClone公司。 PCR仪购自LongGene公司;超声破碎仪购自sonics公司;AKTA蛋白纯化仪购自通用电气公司。 LB和LBB[LB添加1%(W/V)脑心浸出液]若用到固体，均补加%(W/V)琼脂粉，若用到氯霉素或卡那霉素抗生素，针对E. coli和C. glutamicum的工作浓度分别为30和10μg/mL。 方法 从NCBI获取天然人胃内因子的氨基酸序列，对其编码序列进行密码子优化，由苏州金唯智有限公司进行序列合成，获取重组基因克隆载体pUC57-kan-rgif。 -rgif的构建 以pUC57-kan-rgif为模板，以rgif-F和rgif-R为引物，PCR克隆rgif。引物序列如下: 采用分子克隆技术将pXMJ19和rgif构建表达载体pXMJ19-rgif(图1)，经氯化铷法转化 DH5α，筛选得到阳性克隆菌。 /pXMJ19-rgif的构建 采用文献所述转化方法[12]将构建好的质粒pXMJ19-/pXMJ19-rgif，并通过菌落PCR进行阳性克隆菌的验证。为了能够更好地反映GIF的表达情况，同时构建空质粒克隆/pXMJ19做对照。 图1 rgif的基因合成和pXMJ19-rgif的构建 /pXMJ19-rgif和/pXMJ19的诱导表达 /pXMJ19-rgif和/pXMJ19分别接种于5 mL氯霉素抗性的LBB，于30℃220 min培养过夜，之后转接到100 mL新鲜的氯霉素抗性LBB，培养10 h时分别添加100μL浓度为100 mmol/L的IPTG，继续发酵18 h后收获菌体进行蛋白分析。 /pXMJ19-rgif的发酵条件优化 根据预实验以及查阅文献[13]，研究诱导剂浓度，诱导时机，发酵时长和发酵温度对/pXMJ19-rgif发酵产GIF的影响。本优化采用正交试验设计，各因素的水平如表1所示，试验安排如表2所示。 WB结果灰度分析 使用Image J对GIF的WB结果进行灰度分析，间接对GIF进行定量。 GIF蛋白纯化及定量 表1 GIF发酵条件正交试验因素与因素水平 取20 mL发酵液，收集菌体沉淀，用10 mL镍柱纯化溶液A重悬