单细胞靶向测序基础上基因碱基突变技术的探索.docVIP

单细胞靶向测序基础上基因碱基突变技术的探索 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 2 文1：单细胞靶向测序基础上基因碱基突变技术的探索 2 1、材料与方法 3 2、结果与分析 5 3、讨论 8 文2：单细胞－－四无企业的高速坦途 10 一、四无企业可以辉煌 10 二、选择“单细胞道路” 11 （2）资本少。微小企业别名“弱小企业”，有资金微弱的意思。 12 （3）知名度不高。微小企行业地位不高，所以没有知名度。 12 三、企业核心能力就是“关键人物核心能力” 13 1、老板个人具有核心能力 13 （1）勤奋、努力、亲力亲为 14 （2）激励团队 14 （3）取得别人信任的意愿与能力 14 2、有核心能力的关键个人 15 3、建立一种机制，让“有核心能力的人”脱颖而出 15 （1）公司经营商小型化、权力下放 16 （2）减少层级、增加被管理者数量 16 （3）公司在平台建设上，实现“集权” 16 四、整合外部资源 16 1、确定你整合资源的范围、目标 17 四无企业，无法以品牌来凝聚资源。所依靠的，是朋友的信任。 17 （1）合作对象战略 17 （2）合作方式差异化 18 （3）经营你的资源网络 18 五、暴风雨来了 18 3、市场竞争激烈，企业不能在找人、管人方面虚耗太多精力。 19 1、大企业主动肢解 19 2、新工厂从“虚拟经营”起步 19 3、总部转型为“虚拟经营” 20 （1）业务开发，就是“接单”和“客户服务” 20 （3）企业战略管理 20 4、市场营销的尽量外包 20 参考文摘引言： 20 原创性声明（模板） 22 文章致谢（模板） 22 正文 单细胞靶向测序基础上基因碱基突变技术的探索 文1：单细胞靶向测序基础上基因碱基突变技术的探索 肿瘤组织内部除了含有血管、基质细胞和浸润的免疫细胞外，还包含具有不同遗传变异的肿瘤细胞，故而肿瘤是一种高度异质性的疾病[1，2]。此外，肿瘤在形成过程中，其内部的肿瘤细胞因含有不同的突变组合而形成不同的亚克隆群体，且克隆群体会不断进化以适应环境[3]。遗传异质性结合表观遗传异质性等因素会引起肿瘤细胞的表型异质性，进而形成了不同肿瘤细胞对治疗的反应或本身的转移能力不同，最终导致抗药性或复发[4]。为此，揭示肿瘤内部的克隆结构演变规律，将有助于理解其发生发展机制，为今后癌症患者的个性化治疗提供理论基础。 目前，研究肿瘤组织内部细胞克隆结构演化的方法之一是对不同区域取样进行群体水平的外显子测序，通过检测基因突变的发生频率(variant allele frequency，VAF)从而探索肿瘤细胞的发生发展过程[5，6]。该方法存在的不足之处在于，群体细胞中不仅含有肿瘤细胞，而且同时混有其他类型细胞，这很容易导致肿瘤细胞中特有的所占比重较少的突变信息被掩盖[7]。单细胞全外显子测序可以有效解决这一问题，但考虑到测序成本问题一般难以大规模应用，部分研究者以单细胞靶向测序作为替代方案[8，9，10] 利用单细胞靶向测序技术，本研究建立了一种优化的有效靶向分析大规模单细胞中特定碱基突变的方法。通过结合组织酶解方法、微流控单细胞分离、多重置换扩增(multiple displacement amplification，MDA)、外显子组测序和单细胞靶向扩增技术组建了探究肿瘤单细胞水平基因碱基突变的方法。首先以HepG2细胞为例优化MDA技术，并将建立的方法应用到一例人类前列腺基底细胞癌(prostate basal cell carcinoma，BCC)患者的肿瘤样本，通过对混合单细胞样品全外显子测序结果分析找到BCC肿瘤细胞中存在的克隆碱基突变点，并在单细胞水平上通过靶向扩增及Sanger测序验证该突变的存在，从而为绘制肿瘤细胞克隆演化过程奠定基础(图1) 1、材料与方法 实验材料 HepG2肝细胞癌细胞系来自ATCC。人类前列腺基底细胞癌(prostatebasal cell carcinoma，BCC)样本来自上海交通大学医学院附属仁济医院。 单细胞悬液的制备 组织样本用剪刀剪碎，加入胶原酶IV于37℃孵育30～120 min，经70μm滤膜除去消化不完全组织和裂解红细胞后以100 g离心5 min，再进行洗涤重悬获得单细胞悬液。制备的单细胞悬液经计数及细胞直径测量后用于后续的单细胞分离、捕获、基因组扩增、生物信息分析和靶基因扩增及验证等。 单细胞捕获及全基因组扩增 单细胞由美国Fluidigm公司的C1芯片捕获，单次最多可捕获96个单细胞。单