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快速检测地衣芽孢杆菌活菌制剂芽孢数的方法研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：快速检测地衣芽孢杆菌活菌制剂芽孢数的方法研究 1 1、材料与方法 2 2、结果 5 3、讨论 7 文2：薏苡黑穗病快速检测方法研究 9 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 快速检测地衣芽孢杆菌活菌制剂芽孢数的方法研究 文1：快速检测地衣芽孢杆菌活菌制剂芽孢数的方法研究 地衣芽孢杆菌活菌制剂是一种微生态活菌制剂，具有提升人体免疫力和预防疾病等作用，近年在临床治疗中逐渐广泛应用[1]。微生态制剂产品的质量控制关键在于对该制品的安全性和有效性的评价[2]。中国药典2015年版三部微生态活菌制品总论规定微生态活菌制品必须由非致病的活细菌组成，无论在生产过程、制品贮存和使用期间均应保持稳定的活菌状态[3]。其中，地衣芽孢杆菌活菌制品芽孢数和芽孢率作为芽孢杆菌性能的重要指标，只有当芽孢数和芽孢率较高时才能发挥较好的益生效果[4]。然而，目前市场上或生产企业的一些地衣芽孢杆菌活菌制品随着保存时间的延长，其有效活菌数量严重下降；有些活菌制品在制成制剂的过程中，受到来自药品中其他粉体原料的摩擦和挤压，造成菌体破裂导致死亡[5]。传统检测地衣芽孢杆菌活菌制剂的方法有平板计数法和孔雀绿染色法。前者操作繁琐，检测周期长，严重滞后于生产过程；后者染色困难，只能检测芽孢率，不能计数芽孢数量。随着微生物快检技术的发展，也出现了如流式细胞术等快速检测方法。但因仪器成本较高，专业性较强，目前该方法使用率并不高。因此，研究地衣芽孢杆菌活菌制剂芽孢数的快速检测且简单易行方法非常必要。 2，6-吡啶二羧酸(dipicolinicacid，DPA)是在芽孢杆菌的营养体中不存在，当芽孢杆菌处于芽孢状态时才产生的一种特异成分，占芽孢干重的5%～10%[6]，因此可以通过检测芽孢中的DPA来验证芽孢体的存在。韩雪等[7]对脱脂乳进行处理，采用紫外光度法测得DPA的A值，建立芽孢数与DPA的关系，根据回归方程只能半定量预测出脱脂乳中芽孢数量。本研究采用HPLC，建立地衣芽孢杆菌活菌制剂中DPA的定量检测方法，同时用传统的平板计数法对相应的芽孢悬液中芽孢数量进行统计，建立DPA浓度与芽孢数之间的关系曲线，以期通过测定样品中DPA含量，间接定量测定地衣芽孢杆菌活菌制剂的芽孢数。 1、材料与方法 仪器 MLS-3780高压蒸汽灭菌器(三洋工业株式会社)；KB240低温生化培养箱(BINDER公司)；Seven Easy酸度计(梅特勒-托利多公司)；BS223S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；DK-S24电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备公司)；IS-RDD3台式恒温振荡器(美国精骐有限公司)；Z206A离心机(德国HERm LE公司)；LA2-4A1生物安全柜(新加坡艺思高科技有限公司)；Agilent1260高效液相色谱仪(Agilent公司)；Wate e2695高效液相色谱仪(Wate公司) 材料 地衣芽孢杆菌活菌菌粉(批号：，含量×1010 CFU·g-1)、地衣芽孢杆菌活菌胶囊(批号：，，；规格：每粒 g)、地衣芽孢杆菌活菌片(批号：，，；规格：每片 g)、地衣芽孢杆菌活菌颗粒(批号：，，；规格：每袋 g)，均由浙江京新药业股份有限公司提供。营养琼脂培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司，批号：)，经培养基适用性检查，结果符合规定；氯化钠(国药公司，批号：);DPA对照品(ALDRICH公司，批号：BCBP3374V；纯度：99%)；二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)(Roche Diagnostic公司，批号：)；氢氧化钠(兰溪市华盛化工有限公司，批号：050615)；十二烷基硫酸钠(SDS，香港迪韻科技有限公司，批号：110826);DTT溶液[7]：称取氢氧化钠、氯化钠、SDS、DTT适量，置同一量瓶，加水溶解并稀释，最终各成分浓度分别为100 mmol·L-1氢氧化钠、100 mmol·L-1氯化钠、10 g·L-1 SDS和100 nmol·L-1 DTT。 方法 . 1色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为30℃，%磷酸-甲醇(92∶8)为流动相，检测波长为273 nm，流速为 m L·min-1。 . 2对照品溶液的制备 精密称取DPA对照品 mg，用水溶解并定容至200 m L，制成质量浓度为200 mg·L-1的母液，在4℃下贮存；取母液分别用水稀释，配制质量浓度为80，40，20，10，5， mg·L-1的对照品溶液。 . 3供试品溶液的制备 无菌称取地衣芽孢杆菌活菌菌粉(批号：) g，加