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建立以外周血单个淋巴细胞遗传分析及其在遗传性疾病诊断中的应用 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：建立以外周血单个淋巴细胞遗传分析及其在遗传性疾病诊断中的应用 1 1、材料与方法 2 2、结果 4 3、讨论 5 4、结论 6 文2：外泌体提取技术及其在疾病诊断中的应用 6 1 、外泌体的生物学特性 7 2、 外泌体提取方法 8 3、 外泌体在人类不同疾病中的研究进展 10 4、 结语 14 参考文摘引言： 14 原创性声明（模板） 16 文章致谢（模板） 16 正文 建立以外周血单个淋巴细胞遗传分析及其在遗传性疾病诊断中的应用 文1：建立以外周血单个淋巴细胞遗传分析及其在遗传性疾病诊断中的应用 单细胞研究于生物医学研究领域有着重要的意义，其被列为未来最值得关注的研究领域之一。单细胞分离是实现单细胞研究的基础，现有的分离技术有荧光激活细胞分选法、激光捕获显微切割、免疫磁珠法、微流控技术、连续稀释分离法、显微操作分离法等[1，2]。荧光激活细胞分选法、激光捕获显微切割、微流控技术等需依赖特殊的仪器，分选费用高，难以普及；连续稀释分离法操作简单，但大量存在的空白孔和多细胞孔需要研究人员观察排除，费时费力。本研究结合稀释法及体视镜下可视化显微操作，意在建立快速、简易、准确的单细胞分离技术，并采用基于多重退火环状循环扩增技术（MALBAC)[3]，旨在获得高覆盖度的单细胞全基因组扩增（WGA）产物，实现遗传性疾病的诊断。 1、材料与方法 材料 经厦门大学附属东方医院门诊收集11例体检健康者，β-珠蛋白生成障碍性贫血（β41-42M/βN型杂合突变个体）、法布里病（GLA基因第601位碱基由T突变为G，杂合突变个体）、先天性肾病综合征（NPHS1基因第274位碱基由G突变为A，杂合突变个体）携带者（各1例，每例后续均进行3次单细胞WGA）乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝新鲜外周血。 仪器与试剂 仪器：自制单细胞分离装置；体视镜（Leica）；细胞培养皿（BDFalcon);PCR反应仪（珠海黑马）；凝胶电泳仪、凝胶成像分析仪（北京六一）；台式高速冷冻离心机（珠海黑马）。试剂：淋巴细胞分离液（Axi-shield）；单细胞WGA试剂盒（江苏亿康）；PCR-反向点杂交试剂盒（亚能生物）；rTaqDNA聚合酶（Takara） 方法 外周血、PBS缓冲液等体积（均约2mL，实验所涉及的PBS不含Mg2+、Ca2+）混匀加入含3mL淋巴细胞分离液于离心管内，2000min20℃水平离心20min，吸取分离液与血浆间的白膜层；吸取液内加入5mLPBS缓冲液混匀，1500min20℃水平离心10min，弃上清液；加入2mL红细胞裂解液孵育5min，500×g离心5min，弃裂解液；加入5mLPBS缓冲液，1200min20℃离心10min，弃上清液，重复操作1次；加入1mLPBS缓冲液重悬，分离前后分别制备细胞涂片评估分离效果。 细胞培养皿上加1μL细胞重悬液，补PBS形成体积约7μL的液滴。连于自制单细胞分离装置的移液器，量程调至60μL，在体视镜下自液滴吸取100～200个细胞打至培养板空白位置，补PBS形成7μL新液滴；自新液滴吸取10～50个细胞，打至新的位置并补加PBS，如此反复至每个体视镜80倍视野仅可见2～3个细胞；将移液器量程调至30μL，在镜下缓慢吸取单个细胞，吸取到单个细胞后轻推可见单细胞从针口跳出，将单细胞吸回直接打入灭菌PCR反应管。 采用亿康MALBAC单细胞WGA试剂盒，严格按照说明书步骤操作，产物初定量及琼脂糖凝胶电泳后行后续扩增。 比较WGA产物及对应外周血DNA目的基因一代测序结果，探讨本研究对遗传疾病诊断的价值。所涉及的引物见表1。 表1目的基因扩增所用引物序列 PCR体系如下：10×缓冲液μL，，rTaq酶μL，模板1μL，纯水μL。反应条件：（1）变性95℃3min。（2）扩增95℃30s，相应的退火温度30s，72℃1min，扩增重复35个循环（退火温度：HBB56℃；GLA55℃；NPHS160℃）。HBB、GLA、NPHS1预计扩增片段长度分别为519bp、433bp、318bp，琼脂糖凝胶电泳出现清晰目的条带的产物即送公司测序。 -反向点杂交法验证 HBB基因杂合突变个体单细胞WGA产物行PCR-反向点杂交法探讨本研究对β-珠蛋白生成障碍性贫血临床常规诊断的价值，操作严格按照PCR-反向点杂交试剂盒说明书进行。 2、结果 外周血单个淋巴细胞的分离 淋巴细胞分离液处理前外周血白细胞以分叶核中性粒细胞为主，平均占比63%，分离后淋巴细胞平均占比94%，如图1所示，分离效果良好。经红