DNA提取方法总结计划.docVIP

各种DNA提取方法 一，基因组DNA提取方法 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，平时要求获取的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量防备使DNA断裂和降解的各种要素，以保证DNA的完好性，为后续的实验打下基础。主若是CTAB方法，其余的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍 法碱裂解法3生物方式:酶法。依据核酸分别纯化方式的不同样有: 硅质资料、阴离子交换树脂等 试验步骤： 、贴壁细胞用胰酶消化，离心采集。 、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心采集。试验步骤2再重新作一边。 、加入5mlDNA提取缓冲液， (10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。 4、加入25ul蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml混匀，50℃水浴3h  10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8 .0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加 灭去离子水至100ml， 高压灭菌 试验步骤： 1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000，μl充分颠混至清明。 4000rpm，离心5min。弃上清液。 2、积淀中加入ligsisbuffer1500，μl充分匀浆。以6000rpm，离心 5min。 3、完全弃去上清，加入extractionbuffer500（μl裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。 4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是 ℃收效要好些）。 5、每管加入450μl饱和酚（取溶液基层）迟缓摇晃10min，以 5500rpm，离心15min。 6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心采集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混杂物抽提一次，2500r/min离心采集水 相 6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的 LiCL混匀，冰浴，10min.。 7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。2500rpm离心10min。弃上清。 8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。 9、12000r/min室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适合TE中。 二，外周血DNA提取技术 分别外周血白细胞 提取方法： 试验步骤： 1 、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。 2 、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml 离心管中。 3 、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。 4 、2500rpm离心10min，弃上清。 5 、加入10ml 溶血液，摇匀，冰浴15min。 6 、3000rpm 离心10min，弃上清。 、倒置离心管，去掉残液。 、得白细胞，－80℃冻存。试验要求： 血至分别白细胞之间隔时间在室温下放置不高出2h，4℃放置不高出5h，以防白细胞自溶。 三，氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA： 试验试剂： Ligsisbuffer： 133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0. ；最后加灭菌去离子水至1000ml， 高压灭菌。ACD抗凝剂：__________柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g 葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。 提取缓冲液（Extractionbuffer）： 优选  10min，以5500rpm，离心15min。 7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以 5500rpm，离心15min。 8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适合无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。 9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以 12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。 10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。 四，NaI提取法提取外周血白细胞基因组： 实验步骤： 1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。 2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。 3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。 4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。 5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反