第二十一章DNA重组及重组DNA技术.pptVIP

平端连接 限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 适用于： 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 3. 粘-平末端连接 黏-平末端连接是指目的DNA和载体之间通过一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接。 属于定向克隆 受体菌条件： 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式： 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) （四）重组DNA转入受体细胞——转 第三节 重组DNA技术基本原理 和操作步骤 基本原理 目的基因的获取 DNA导入受体细胞 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 （一）目的基因的分离获取——分 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 PCR法 从基因组DNA文库中获取目的DNA 从cDNA文库中获取目的DNA 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 2、PCR技术的工作原理 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 PCR技术原理示意图 PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ PCR体系基本组成成分 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段； 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段； 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。 PCR技术的主要用途 （一）目的基因的克隆 利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。 PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。 （三）DNA和RNA的微量分析 （二）基因突变 将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度； 待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。 PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性 。 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析 逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。 （一）逆转录PCR技术 几种重要的PCR衍生技术 原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。 原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。 实时PCR技术原理 Q R 3 3 5 5 上游引物 下游引物 荧光标记引物 R Q 3 3 5 5 实时PCR分类： 实时PRC 非探针类 探针类 1. TaqMan探针法 2. 分子信标探针法 3. FRET探针法 图20-3 TaqMan探针法实时PCR原理示意图 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 从基因组DNA文库获取目的基因 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R