PCR技术与应用课件.pptxVIP

;;1.PCR技术原理与条件;2.PCR技术的过程;2. PCR的6个问题释疑;问题2 PCR技术中加入的“引物”是什么？有什么作用？引物会在PCR仪中复制吗？;问题3 PCR引物的设计有遵循什么原则？;④一条引物自身不能有大于4bp的反向重复序列或自身互补序列的存在，这种序列可形成发夹结构。如果这种结构在PCR条件下稳定，它会非常有效地阻止引物和模板之间的退火。 ⑤两条引物的退火温度相差不能大于5℃。如果相差太大，操作时一般选择较低的那个退火温度，那么另一条引物的非特异性结合就会增加。 ⑥引物3端的性质非常关键，如果可能的话，最末及倒数第二个碱基的最佳选择是G和C。 ⑦实际应用中最重要的一点，设计的引物在合成之前，有必要在DNA数据库中进行BLAST检测，以确保引物中的序列只在所扩增的基因中出现，而与其他基因不具有互补性。;问题4 为什么细胞内DNA复制的引物是RNA？PCR的引物是DNA？;再从DNA分子复制的忠实性看，一般DNA分子两端的碱基对不稳定，因此在合成起始段时，开头的几个碱基如果发生差错将不易校正。为了保证产生高保真的DNA分子就得先延长一个要丢弃的引物，使新加上的碱基严格按照碱基互补配对和上下文的联系，以保证复制的忠实性，即中途配对有差错也会通过酶自动修复。另外，使用RNA作为合成DNA的引物，主要在于它易被DNA聚合酶III作为DNA合成终止的信号所识别，使DN