Western blot操作步骤修订版本.docxVIP

Western blot 操作步骤 实验原理： Western blot ，也称 Western blotting、蛋白印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。 Western blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)，被检测物是蛋白质，“探针”是抗 体, “显色”用标记的二抗.经过 PAGE 分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如 PVDF 膜)上， 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固 相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应 ,再与酶或同位素标记的第二抗体 起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 该技术 也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 内参: WB 过程监测以及目的蛋白定量的标准；最重要和最不可或缺的对照就是内参照 . 1.内参可检测整个 WB 实验过程及体系是否正常工作，如果一个实验连内参照都出不了阳性 结果的话(在内参抗体有效的情况下) ,那么这个体系就是存在问题的； 2、起半定量的标准的作用,内参一般选择管家基因编码表达的蛋白,在很多组织和细胞中都是 稳定表达的，因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准； 内参名称 beta-actin 分子量大小 43kDa 适用范围 胞浆和全细胞 GAPDH 30-40kDa 胞浆和全细胞 Tubulin 55kDa 胞浆和全细胞 VCDA1/Porin 31kDa 线粒体 COXIV 16kDa 线粒体 TBP 38kDa 细胞核 实验步骤 一、 蛋白样品制备(组织中总蛋白的提取) 第一步: 法( 1 )敲取 0.07-0。 1g 组织+400— 500ul 裂解液，放入打样管，放入打样机打样。 法(2)实验室研钵研磨：取稍大于 0.1g 的样品放入研钵中，加少量液氮冻硬，用研杵来回研磨 至粉末状，用枪头刮取收集入离心管。 注：任何操作都要在液氮中进行，并且要将枪头和离心管提前泡在液氮中。 第二步：取出的样品放置冰上 1 — 2h(中间混匀 5 —6 次)直至裂解完全。 第三步：样品离心×2,取上清于新的 EP 管中。 (离心条件： 13000rpm,4℃， 30min ) 注：离心机提前预冷至 4℃。 二、蛋白含量的测定 第一步：在 96 孔板第一列 1 —8 分别为浓度为 0 ，1 ，2 ，4,6 ，8 ，9 ，10 倍的蛋白标准液+水=10 或 20ml ，再加上 5 倍稀释的考马斯亮蓝染液 200ml。 第二步：在 96 孔板后面几列依次加入稀释的蛋白样品或原液 10-20ml 以及 5 倍稀释的考马 斯亮蓝染液 200ml。 注:原液浓度太高时进行稀释，用裂解液稀释。 三、电泳 第一步：清洗玻璃板 将玻璃板在蒸馏水下冲洗干净，去除杂质,再用去离子水清洗一遍，自然晾干 . 第二步：配胶 (1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶 . (2)配分离胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板 3/4 位置时即可。然后胶 上加一层水，液封后的胶凝固更快. 注：加水液封时须缓慢，否则胶会被冲变形。 (3 )当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝固。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩 胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶,然后将梳子插入浓缩胶中。待到 浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 注：插梳子时要使梳子保持水平，两边对齐垂直插入。 (4)用水冲洗一下浓缩胶,将其放入电泳槽中。 (小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一 块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外 . ) 第三步:上样 (1)测完蛋白含量后，计算含 50mg 蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋白加入 4:1 5×Loading Buffer 于离心管,100℃水中煮 5min 使蛋白变性。放置冰上 3min ，离心 15min ，13000rpm,4℃。 (2)加足够的 1×电泳缓冲液后开始准备上样。(电泳液至少要没过内测的小玻璃板。)用微 量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡.将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加 样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。 ) 第四步：电泳 浓缩胶 80V 电压跑 20 分钟，至蛋白 marker 分离即可加压,也可多跑几分钟；分离胶 120V 电压跑至底端。 第五步：停止电泳 纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶,在 Marker 下方切角做标记,将胶泡在清水中。 四、转膜(跑胶时准备转膜用品，最主要赶气泡) 第一步：剪 PVDF 膜，并提前切角标记方向,甲醇中泡 1 —3min。 第二步：将膜、海绵、滤纸一起泡入 1×转膜