生化实验六过氧化氢酶米氏常数的测定.docVIP

生化实验六过氧化氢酶米氏常数的测定 生化实验六过氧化氢酶米氏常数的测定 生化实验六过氧化氢酶米氏常数的测定 南京大学生命科学学院11级拔尖班张茜111070094 过氧化氢酶米氏常数的测定 生命科学学院11级拔尖班 111070094张茜 一、实验目的 认识米氏常数的测定方法 学习提取生物组织中的酶 二、实验原理 实验中的反应 H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2,未分解的H2O2用KMnO4在酸性环 境中滴定,依据反应前后的浓度差能够算出反应速度: 酶 2H2O2-→2H2O+O2 2KMnO4+5H2O2+3H2SO4-→2MnO4+K2SO4+8H2O+5O2 本实验以马铃薯供给过氧化氢酶,以1/v～1/[S]作图求Km. 米氏反应动力学 米氏方程(Michaelis-MentenEquation): 1/4 南京大学生命科学学院11级拔尖班张茜111070094 2/4 南京大学生命科学学院11级拔尖班张茜111070094 三、实验试剂 1.0.02mol/L磷酸缓冲溶液(pH=7.0):实验室供给. 酶液:称取马铃薯5g,加缓冲液10mL,匀浆过滤. 3. 0.01107mol/L 高锰酸钾. 4. 0.098mol/L H2O2. 25%H2SO4. 四、实验操作 取6只锥形瓶,按表1的次序加入试剂. 先加好过氧化氢和蒸馏水,加酶液后马上混淆,挨次记录各瓶的初步反应时间. 反应抵达5min马上加入硫酸停止反应,充分混匀.用0.0109mol/L的KMnO4 溶液滴定瓶中节余的过氧化氢至微红色,记录耗费的高锰酸钾体积. 3/4 五、实验结果与谈论 1.实验结果 管号 0 1 2 3 4 5 实质耗费KMnO4/mL 0.00 2.99 3.93 5.44 7.94 15.89 v/(mmol/min) 0 0.00474 0.00367 0.00546 0.0073 0.00844 [S]/(mol/L) 0 0.0098 0.0123 0.0164 0.0245 0.0490 1/ v — 327.8 364.0 381.4 197.9 99.5 1/[ S] — 102.0 81.6 61.1 40.8 20.4 表2:实验结果和计算结果 双倒数作图 450 400 y=3.0479x+87.607 381.4 R2=0.6584 350 364.0 327.8 300 250 1/v 200 197.9 线性线 150 100 99.5 50 0 0 20 40 60 80 100 120 Km=斜率/截距=0.03479 4/4