分子生物学实验.pptxVIP

目 录;;一、实验目的;二、实验原理;三、实验材料与试剂物品;2、试剂;3、仪器设备;四、实验操作流程;五、结果与处理;; 实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取;目的与要求 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。;2. 相关知识及原理;;第15页/共110页;DNA超螺旋结构;常用的质粒载体;细菌质粒: 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。 ;严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。;载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。;Insert;抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene) 启始复制子（ori, Origin of replication)； 多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)； 标记基因(Marker gene, such as LacZ gene)。;　　　　Ampr抗性基因;　二、实验原理 ;DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。;SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。;细菌裂解的方法： 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水???沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。;提纯的思路;测定DNA浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于粗略检测DNA浓度的方法是通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。;紫外光吸收法： 因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。;3. 材料与试剂 材料:含有质粒大肠杆菌JM83+。;三、实验仪器、材料与试剂 ;;;　　　　四、实验步骤;? 加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性 ? 12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管 ? 上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀） ? 12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管 ? （可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀） ? 12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管 ? 上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴 30min ?;12000rpm，离心15min ? 沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心） ? 12000rpm，离心10min ? 沉淀超净台中风干 ? 沉淀用20uL RTE溶解，-200C保存;注意： 用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！！！;培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时; 取液体培养液于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100?l溶液1(GET) ，充分混匀放置3-5分钟; 加入200?l新配制的0.2mol/L NaOH+1％SDS（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min