抗体库技术学习.pptxVIP

第1页/共67页通过DNA重组技术克隆全套抗体可变区基因,并在原核系统表达有功能的抗体分子片段,这种全套抗体基因表达文库称为抗体库---沈倍奋:重组抗体在蛋白质组学研究中的应用-细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2003, 19(2):105-106第2页/共67页抗体库技术的主导思想，是 将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达 利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体第3页/共67页 基因工程抗体技术，是继杂交瘤单克隆抗体技术以后抗体领域的又一次革命 噬菌体抗体库技术又被誉为这次革命中的革命第4页/共67页该技术的最大优势在于可以使人们绕过杂交瘤和免疫而建立天然全套噬菌体抗体展示文库， 从库中容易地筛选出任一感兴趣的抗体第5页/共67页抗体库技术包括的主要过程：克隆出抗体全套可变区基因与有关载体连接导入受体菌系统利用受体菌蛋白合成分泌等条件，将这些基因表达在细菌、噬菌体等表面进行筛选与扩增，建立抗体库第6页/共67页本章内容5.1 初期的抗体库5.2 噬菌体抗体库技术5.3 大容量抗体库5.4 抗体库技术的应用第7页/共67页5.1 初期的抗体库5.1.1 背景5.1.2 初期的抗体库第8页/共67页5.1.1 背景DNA重组技术的发展和抗体基因结构的阐明，促进了80年代初基因工程抗体的发展基因工程抗体，极大地改善了抗体的性能和扩展了抗体的应用范围第9页/共67页抗体库技术，通过DNA重组技术，克隆全套抗体可变区基因，在原核系统表达有功能的抗体分子片段（即抗体库），从中筛选特异性抗体的基因。第10页/共67页两项关键技术：PCR：用一组引物，扩增出全套免疫球蛋白的可变区基因以大肠杆菌(或噬菌体)直接表达有功能活性的抗体分子片段第11页/共67页噬菌体展示技术（phage display）应用到抗体的表达与克隆第12页/共67页5.1.2 初期的抗体库Ward 等:溶菌酶免疫小鼠脾细胞DNAPCR扩增出VH基因大肠杆菌表达出VH段21 /2，000个克隆与溶酶体特异性结合的克隆第13页/共67页1989年 Huse 等， 在Science上发表了完整的抗体库工作：用逆转录-PCR技术从淋巴细胞克隆出抗体轻链基因库（repertoire）和重链Fd段基因库 Repertoire 所有的节目第14页/共67页将轻链和重链基因分别组建到噬菌体表达载体中，得到轻链基因库和重链Fd段基因库通过DNA重组技术将轻链基因和Fd段基因随机配对重组于一个表达载体中，形成组合抗体（基因）库P109 第15页/共67页感染大肠杆菌，噬菌体形成噬菌斑相应噬菌体载体上的κ链基因和Fd段基因得到表达，形成有功能的Fab段，释放于噬菌斑内第16页/共67页将噬菌斑转印到硝酸纤维素膜上用标记的抗原筛选产生特异性抗体的克隆，得到其Fab段的基因，建立了完整的抗体库技术第17页/共67页较细胞融合杂交瘤技术的优越性：1. 省去了细胞融合的步骤2. 扩大了容量， 106 以上个克隆3. 直接得到抗体的基因，不丢失，便于进一步构建抗体4. 利用原核表达系统的优势5.可制备难于制备的抗体第18页/共67页5.2 噬菌体抗体库技术噬菌体展示技术 （phage display technology）的应用第19页/共67页第20页/共67页5.2.1 噬菌体展示技术将肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中?与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白?呈现于噬菌体表面特点：将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内第21页/共67页第22页/共67页5.2.1.1丝状噬菌体M13 fd f1第23页/共67页复制型DNA被用来做基因克隆的载体基因组为单链环状DNA基因中有一段基因间隔区（intragenic region）,含有病毒合成的起始和终止信号，以及子代噬菌体生成组装的信号第24页/共67页基因组共编码10种蛋白质，包括结构蛋白和DNA 合成和子代噬菌体的包装释放所需蛋白管状蛋白外壳，蛋白Ⅷ（2 700-3 000个）， 蛋白质Ⅲ 和Ⅵ，蛋白质Ⅶ和Ⅸ第25页/共67页第26页/共67页噬菌体对大肠杆菌的感染：1.通过蛋白质Ⅲ对细菌表面性菌毛的识别感染细菌2.感染后其基因组DNA 进入细菌3.DNA 转变为双链DNA4.在噬菌体蛋白的作用下，复制大量单链DNA 5.与细胞膜上的噬菌体外壳蛋白组装成完整噬菌体。第27页/共67页用于噬菌体展示的基因Ⅷ和Ⅲ蛋白蛋白Ⅷ：50个氨基酸，中央一段疏水，可先镶嵌在细菌内膜上；可多价表达。当外源蛋白的基因与基因Ⅷ融合，就会在噬菌体表面表达第28页/共67页蛋白Ⅲ：406个氨基酸，在感染的细菌内，羧基端固定在内膜上，氨基端朝向质周腔 每个噬菌体有3