酶切若干问题.docxVIP

酶切现象及影响因素详解 1先说一下酶切对象(1)质粒 要是对质粒进行酶切，那么质粒的纯度挺重要，污染有DNase和残留质粒提取中的 酚以及高盐对DNA酶切都不利，还有RNA要去除洁净。以上所提的这些这都会影响酶切效果。 解决方法DNase污染：质粒提取的试剂都要进行灭菌，提取时不要拖拉，电泳缓冲液要长换, 以免电泳液造成DNA降解，电泳液的pH不要偏酸，简单降解DNA,在最终溶解DNA时，可以采纳 TE和水，建议用TE, TE可以鳌合金属离子，使DNase失活。酶切时，TE也会有肯定影响，但你 可以将溶解DNA时的TE少加点。酶切时，取的DNA的体积就可以削减，经水稀释，就问题不了。 RNA的去除：一般将RNase加到TE中，经过37度温育一段时间就可以将RNA很好的去除1—2 个小时就行。 酚的污染：首先在用酚仿抽提时，就要留神不要吸到下面的有机溶液，要是为了保险可以再用氯 仿单独抽提一下，就可以很好的避开酚的残留。 高盐的去除：提取质粒时一般盐的浓度很高，假设有人在70%乙醇洗盐这步不做，也会影响后面 酶切。 (2) PCR产物PCR产物经电泳检测是单一目的条带可以直接酶切，假设是杂带许多，就要将 目的片段回收再酶切。一般在设计引物的时候，会在5端引入酶切位点，但是不要忘了在酶切 位点外面加几个保护碱基。加入4个比拟保险，假如没有保护碱基，内切酶是无法切断DNA的, 即使加入保护碱基，酶切效率也会较低，需要长时间酶切。 (3)基因组DNA将基因组做酶切一般是在southern blot时常用，这时酶切体系一般较大, 由于基因组中目的基因的比例是很小的，酶切之后转膜又会有损失，因此多做一点酶切产物，才会获 得较好的杂交效果。内切酶也要多加一些，一般都要酶切一夜，才能完全酶切。 2、用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序吗？还是肯定要做T载体连接? 1) MBI的内切酶还可以，Xbal用过，酶切效率不高，酶切过的质粒做的比照也有转化子,我想确定没有切完全或酶切后没有胶回收。 2)用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序，并不是肯定要做TA克隆，PCR产物酶切后可以直接连接到你的载体上。 wolfdance wrote: EcoRI和BamHI是能够同时进行酶切的，我做过，效果很好。用的是NEB的美和Buffer。双酶切时应当用EcoRI的buffer. 我现在遇到的一个问题是：PC R产物连接到p G EM—T载体后测序觉察，我当时引物 设计时加上的一个E c o r I的酶切位点不见了，末端少了 两个碱基，G Ao 我用的酶 是生工的T a q plus, 最初我坚信是引物的问题，可后来我看到T a q酶有5，一 3外切酶活性，不知是不是在PC R 是引物的5,端被切掉了两个碱基，导致了酶切位点的消逝。 的消逝。 的消逝。恳请大虾教导迷津。 的消逝。 恳请大虾教导迷津。 我想你的猜测有道理，T a q plus的保真效率高，适合长片段(io-3okb)扩增，公司的说明书上有这样的描述: high fidelity with an error frequency 1.6 / 106 (or 0.0016/103) during DNA synthesis. Taq Plus increases the efficiency of polymerization reaction, resulting in a greatpercentage of extenuation reaction completion up to 10 kb to 30 kb. Pfu has atemperature optimum between 72-78 ℃ and remains 95% actie following 1-hourincubation at 95 ℃. 5端碱基可能与你的酶有关系，最好换其它的酶，假如你要扩增长片段的DNA,可以试一试Takara的Taq Ex。不过高保真与外切酶活性是一个冲突。 我查了一下，还没有说Ta q酶能切掉引物5,端碱基的报道。不知主任是否遇到过这种状况。我想该用p f U, 但他不能直接用于TA克隆。 我的片段有1 4 0 0 b p , 测序后除了引物上有三个碱基错误(两个缺失， 一个错配)外，只有一个碱基与GENEbank不一样。老板让我在重复一次，说不准就没有错误了由于错配饰随机的。。不知这种可能性大不大。 感谢主任的回答 wolfdance wrote: EcoRI和BamHI是能够同时进行酶切的，我做过，效果很好。用的是NEB的美和Buffer。双酶切时应当用EcoRI的buffer. 我现在遇到的一个问题是：PC R产物连接到p GE M— T载体后测序觉察，我当