蛋白质研究的基本实验方法.pptVIP

SDS在浓缩胶运动中，Clˉ解离度大，Proˉ解离度居中，甘aaCOOˉ解离度小，迁移顺序为（PH6.8）Clˉ Proˉ —COOˉ，一个Clˉ领路，—COOˉ推动，蛋白在中间，这样就起到浓缩的作用了。 由于胶联度小，孔径大，Proˉ受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。 当蛋白质进入分离胶时，此时Proˉ，Clˉ，甘aa 离子在PH8.8 的溶液中，Clˉ完全电离而很快到达正极，甘aa 电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。 第31页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 SDS由于Proˉ在电泳过程中，带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就现了电荷效应。由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。 第32页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 SDS第33页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 SDS催化剂：过硫酸铵（AP）在隔氧的状态下，最好现配现用，使用新鲜的。 加速催化剂：TEMED，四甲基乙二胺。催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物。 第34页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 SDS第35页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 SDS上样量：总蛋白量 20-50ug（上样量过多使电泳条带变形） 70V，30min；110V，与待分离样品靶蛋白分子量相适应。 第36页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 SDSElectrophoresis 第37页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 转膜（电转移） 印迹中常用的固相材料有NC 膜、尼龙膜、PVDF 等。 PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。 有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW20kDa)。 第38页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 转膜 NC膜及滤纸的预处理： 剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1×转移缓冲液平衡5分钟以上。（注意：必须保证NC膜始终完全浸于转移缓冲液中） PVDF 膜的预处理： 剪裁与胶大小一致的膜泡入甲醇中，约1-2 分钟。将其浸入1×转移缓冲液平衡5分钟以上。 第39页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 转膜 缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到硝酸纤维素（或PVDF）膜上，膜可以与蛋白质通过疏水相互作用产生不可逆的结合。 有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成三明治形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素（或PVDF）膜上。 第40页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 转膜 第41页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 转膜 电流1mA-2mA/cm2，我们通常200mA-350mA，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间 第42页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 关于蛋白质研究的基本实验方法 第1页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 实验研究三个水平 整体水平：动物模型 细胞水平：形态、功能 分子水平：基因、蛋白质 第2页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 蛋白质的调控 基因序列的变化：ErbB2 染色质水平上基因活化的调节： 染色质的结构（对核酸酶的敏感程度增加） 组蛋白的甲基化（H3-K9 基因沉默，H3-K4 基因活化） 组蛋白的乙酰化 DNA的甲基化（5%C 甲基化 m5C； 5’端CpG ） 第3页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 蛋白质的调控 转录水平的调控 顺式作用元件，反式作用因子（转录因子） 转录后的调控 翻译水平的调控 翻译后调控 磷酸化、糖基化、泛素化 定位 第4页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 蛋白质调控的研究 Qualitative model (cyclins) Quantitative model (CDK) 第5页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 蛋白质研究的基本方法 免疫印迹（Western Blot） 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）